A deficiência congênita de membros (DCM) é uma das anomalias congênitas mais comuns e caracteriza-se por uma hipoplasia ou aplasia de um ou mais ossos dos membros. A DCM apresenta uma heterogeneidade ampla, com aspectos etiológicos abrangendo fatores genéticos diversos e/ou fatores ambientais. Pode se apresentar como um achado isolado ou estar associado a outras anomalias congênitas. O objetivo do estudo foi caracterizar as bases genéticas e avaliar os achados clínico-radiológicos de um grupo de indivíduos com DCM. A casuística foi composta por 44 indivíduos, pertencentes a 35 famílias, que apresentavam acometimento de múltiplos ossos longos ou um único osso longo associado a outras anomalias congênitas e/ou oligodactilia. Os indivíduos foram classificados em formas isoladas ou sindrômicas, pela localização do acometimento nos membros e pelo comprometimento anatômico. Os estudos moleculares empregados foram direcionados para a hipótese clínica aventada e, na ausência de uma hipótese, ou na eventualidade de não haver uma etiologia conhecida, foram realizados o sequenciamento de nova geração (NGS) e o array genômico. Na casuística, o grau de acometimento dos membros foi variável, sendo mais prevalente o envolvimento dos membros superiores e os defeitos longitudinais, particularmente pré e pós-axial. Dentre os ossos acometidos, houve um maior acometimento do rádio (77,3%) e da fíbula (80%) nos membros superiores e inferiores, respectivamente. As formas sindrômicas foram predominantes (65,7%), com uma hipótese clínica estabelecida em 74% dos casos, incluindo síndromes reconhecidamente associadas a DCM, como a síndrome de Rothmund-Thomson (quatro casos) e as síndromes TAR e HoltOram, com três casos cada. Em 16 probandos da casuística (45,7%) foram encontradas variantes intragênicas ou uma variação do número de cópias (CNV)s, 14 no grupo sindrômico e dois no grupo dos não sindrômicos, incluindo a confirmação na maioria dos casos com uma hipótese clínica aventada. Esta maior detecção no grupo das formas sindrômicas (60,8%), comparada com o grupo apenas com anomalias dos membros (16,7%), foi estatisticamente significante, mostrando a efetividade das técnicas empregadas, particularmente o NGS, nas formas sindrômicas. Variantes novas não reportadas previamente na literatura foram encontradas nos genes NSDHL, CTC1, PUF60, TBX5 e WNT7A, ampliando o espectro de variantes associadas a estes genes. Dentre os achados encontrados nas formas sindrômicas clássicas destacam-se dois deles: a presença de uma classe de variante rara, uma duplicação intragênica em TBX5, na síndrome de Holt-Oram e a presença de dois polimorfismos novos, um deles na região 3UTR do gene RBM8A, recentemente descrito na literatura em indivíduos de origem africana, em dois dos três indivíduos analisados com a síndrome TAR. Neste caso, este achado enfatiza as diferenças nas frequências alélicas de variantes comuns e a necessidade de estudos em populações menos representadas globalmente e com grande miscigenação, como a brasileira. Em duas síndromes recentemente descritas, a síndrome Coats plus e Verheij, nas quais a DCM não é considerada um achado cardinal, a presença do defeito préaxial nos dois indivíduos avaliados sugere que este achado possa ser mais comum, a depender das coortes avaliadas. Dentre as formas não sindrômicas, variantes foram encontradas no gene WNT7A o qual pertence a uma das vias importantes para o desenvolvimento dos membros confirmando a hipótese de síndrome de Fuhrmann em um indivíduo e em uma duplicação de BHLHA9 em seis indivíduos de uma família com mãos e pés fendidos com deficiência de osso longo (apenas três com expressão fenotípica, demonstrando uma penetrância incompleta). No grupo de oito indivíduos com diagnósticos clínicos de síndromes sem etiologia genética conhecida, mesmo com o uso de análises amplas, incluindo o sequenciamento do exoma do trio e análise de CNVs, não foi possível identificar uma causa genética. O estudo da etiologia genética na DCM é um desafio dada a complexidade de fenótipos distintos associados a esta anomalia congênita, assim como o não conhecimento das bases genéticas em diversas formas isoladas, não-sindrômicas

Congenital limb deficiency (CLD) is one of the most common congenital anomalies and it is characterized by hypoplasia or aplasia of one or more limb bones. CLD presents great heterogeneity, with etiologic aspects comprising diverse genetic and/or environmental factors. CLD may present as an isolated finding or be associated with other congenital anomalies. The objective of this study was to characterize the genetic basis and to evaluate the clinical and radiological findings of a group of individuals with CLD. The cohort included 44 individuals, belonging to 35 families, that presented involvement of multiple long bones or only one long bone associated with other congenital anomalies and/or oligodactyly. The individuals were classified in isolated or syndromic forms, by the location of the involvement in the limbs and the anatomic commitment. The molecular studies employed were directed to the raised clinical hypothesis and, in the absence of a hypothesis, or in the event that there is no known genetic etiology, next-generation sequencing (NGS) and genomic array were performed. In the cohort, the degree of limb involvement was variable, with the upper limbs being more frequently involved, as well as longitudinal defect, particularly pre and post-axial. Among the affected bones, there was a greater involvement of the radius (77,3%) and fibula (80%) in the upper and lower limbs, respectively. Syndromic forms were predominant (65,7%), with a clinical hypothesis established in 74% of the cases, including classical syndromes known to be associated with CLD such as Rothmund-Thomson syndrome (four cases) and TAR and Holt-Oram syndromes, with three cases each. In 16 probands (45,7%) intragenic variants or copy number variations (CNV)s were detected, 14 in the syndromic group and two in the non-syndromic group, including the confirmation in the majority of the cases with a raised clinical hypothesis. This higher detection rate in syndromic group (60,8%) compared to the group with only limb anomalies (16,7%), was statistically significant, showing the effectiveness of the techniques employed, particularly NGS in the syndromic group. Novel variants, previously not reported in the literature, were found in NSDHL, CTC1, PUF60, TBX5 and WNT7A, broadening the spectrum of variants associated with these genes. Among the findings in classic, syndromic forms, two of them stand out: the presence of a rare class of variant, an intragenic duplication in TBX5, in HoltOram syndrome and the detection of two new polymorphisms, one of them in 3UTR region in RBM8A, recently described in the literature in individuals with an African origin, in two out of three individuals analyzed with TAR syndrome. In this case, this finding emphasizes the differences in allelic frequencies of common variants and the necessity of studies in population less globally represented and highly admixed, as the Brazilian population. In two recently reported syndromes, Coats plus and Verheij, in which CLD is not considered a hallmark, the presence of pre-axial defects in two individuals in this study suggests that this skeletal finding could be more prevalent, depending of the evaluated cohort. Within the non-syndromic group, variants were detected in WNT7A gene which belongs to one important pathway for limb development confirming the hypothesis of Fuhrmann syndrome in one individual and a duplication of BHLHA9 in six individuals of one family with split hand and foot with long bone deficiency (just three with phenotypic expression, demonstrating an incomplete penetrance). In the group of eight individuals with a clinical diagnosis of syndromes without a known genetic etiology, even the use of comprehensive analyzes including exome sequencing of the trio and CNVs analysis, did not allow the identification of a genetic cause. The study of the genetic etiology in CLD is challenging caused by the complexity of distinct phenotypes associated with this congenital anomaly, as well as the lack of genetic bases in several isolated, non-syndromic forms.