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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2021.tde-28102021-134952
Document
Author
Full name
Luiza da Gama Coelho Riccio
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2021
Supervisor
Committee
Abrão, Mauricio Simões (President)
Chapron, Charles
Podgaec, Sérgio
Silva, Julio Cesar Rosa e
Title in Portuguese
O inibidor Btk Ibrutinib limita o desenvolvimento da endometriose em camundongos
Keywords in Portuguese
Camundongos
Endometriose
Imunologia
Linfócitos B
Linfócitos B reguladores
Macrófagos
Abstract in Portuguese
Introdução: Endometriose é uma doença crônica ginecológica caracterizada pela presença e crescimento de células endometriais fora da cavidade uterina. É uma doença inflamatória benigna, porém frequente, afetando cerca de 5-15% das mulheres em idade reprodutiva, causando dor pélvica crônica e infertilidade. A fisiopatologia da endometriose ainda não está completamente esclarecida, e sua progressão está associada à inflamação crônica e a alterações na resposta imunológica. Células endometriais que alcançam a cavidade peritoneal através da menstruação retrógrada escapam dos mecanismos de imunovigilância, provavelmente devido a uma redução da atividade fagocítica dos macrófagos e da citotoxicidade das células natural killer. A imunidade adaptativa também contribui para o desenvolvimento da doença. A presença de uma ativação policlonal dos linfócitos B, com produção de autoanticorpos anti-endométrio, foi descrita em mulheres com endometriose. Porém, o papel exato destas células no mecanismo da doença ainda não é totalmente conhecido. Existe uma necessidade urgente de opções terapêuticas não-hormonais para o tratamento da endometriose e terapias imunes podem trazer novas perspectivas. Objetivo: Avaliar os efeitos da depleção com anti-CD20 e da inativação com o inibidor da Bruton´s tyrosine kinase (Btk) dos linfócitos B no desenvolvimento da endometriose em camundongos. Métodos: Neste estudo experimental, o desenvolvimento da endometriose foi comparado entre um grupo controle e animais tratados com o anticorpo anti-CD20, que causa a depleção dos linfócitos B, e com o inibidor Btk Ibrutinib, que leva à inativação destas células. Foram utilizados dez animais por grupo por experimento independente. Foi utilizado o modelo cirúrgico de endometriose, com transplante de tecido endometrial para a cavidade peritoneal dos camundongos. As lesões de endometriose foram comparadas através do volume, peso, medidas ultrassonográficas, histologia e expressão gênica de genes alvo nos implantes. Os fenótipos dos linfócitos B, B ativados, B regulatórios (Breg), linfócitos T e macrófagos foram avaliados através da citometria de fluxo das células extraídas do baço e fluido peritoneal dos camundongos. Citocinas no soro e no fluido peritoneal foram quantificadas por ELISA. Resultados: O Ibrutinib preveniu o crescimento das lesões de endometriose, reduziu a expressão de ciclooxigenase-2, alpha smooth muscle actine e colágeno tipo I nas lesões, inativou os linfócitos B e aumentou o número de linfócitos Breg no baço de camundongos com endometriose. Além disso, o número de macrófagos M2 diminuiu na cavidade peritoneal dos animais tratados com Ibrutinib, comparados àqueles tratados com anti-CD20 e controles. A depleção dos linfócitos B com o anticorpo anti-CD20 não teve efeito sobre o crescimento e atividade dos implantes, nem sobre os macrófagos. Conclusão: O tratamento com Ibrutinib reduziu o tamanho e a atividade das lesões, bem como a expressão de marcadores de inflamação e fibrose, enquanto a depleção completa dos linfócitos B com o anti-CD20 não teve impacto sobre a doença. No entanto, ainda é incerto se a inativação dos linfócitos através do tratamento com o Ibrutinib poderia interferir no desenvolvimento da endometriose em humanos. Novos estudos podem ajudar a esclarecer o papel dos linfócitos B e seus subtipos na endometriose e contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas
Title in English
Btk inhibitor Ibrutinib limits endometriosis development in mice
Keywords in English
B-lymphocytes regulatory
B-Lymphocytes
Endometriosis
Immunology
Macrophages
Mice
Abstract in English
Introduction: Endometriosis is a chronic gynecological disorder characterized by the presence and growth of endometrial tissue outside the uterine cavity. It is a benign but frequent inflammatory disease that occurs in about 5-15% of women in reproductive age, causing chronic pelvic pain and infertility. The physiopathology of endometriosis is not completely understood, and its progression is associated with chronic inflammation and aberrant immune response. Endometrial cells that reach peritoneal cavity through retrograde menstruation escape immunosurveillance probably due to reduced macrophagic phagocytosis and decreased natural killer cells cytotoxicity. Adaptive immune cells also contribute to disease progression. A polyclonal activation of B cells and the presence of anti-endometrial autoantibodies have been described in a large proportion of women with endometriosis, though their exact role in the disease mechanisms remains unclear. There is an urgent need for new non-hormonal therapeutic strategies and targeting immune system cells can open new perspectives. Objective: To evaluate the effects of B lymphocyte depletion and inactivation on endometriosis development in mice. Methods: The experimental study included comparison of endometriosis development for 21 days in control mice versus animals treated with the anti-CD20 depleting antibody or with the Bruton´s tyrosine kinase (Btk) inhibitor Ibrutinib, that prevents B cell activation. Ten animals per group for each independent experiment were used. After syngeneic endometrial transplantation, murine endometriotic lesions were compared between treated and control mice using volume, weight, ultrasonographic measures, histology, and target genes expression in lesions. Phenotyping of activated and regulatory B cells (Breg), T lymphocytes and macrophages was performed by flow cytometry on isolated spleen and peritoneal cells of mice. Cytokines in the serum and peritoneal fluid were assayed by ELISA. Results: Btk inhibitor Ibrutinib prevented lesion growth, reduced mRNA expression of cyclooxygenase-2, alpha smooth muscle actin and type I collagen in the lesions and skewed activated B cells toward Breg in the spleen of mice with endometriosis. In addition, the number of M2 macrophages decreased in the peritoneal cavity of Ibrutinib-treated mice compared to anti-CD20 and control mice. Depletion of B cells using an anti-CD20 antibody had no effect on activity and growth of endometriotic lesions, neither on the macrophages, compared to control mice. Conclusion: Ibrutinib treatment reduced the size and activity of the lesions, as well as the expression of inflammatory and fibrotic markers, whereas complete B lymphocyte depletion by anti-CD20 had no impact on the course of the disease. However, it is still unclear whether B cell inactivation by Ibrutinib can prevent establishment and/or progression of endometriosis in humans. Further investigation may contribute to clarifying the role of B cell subsets in human endometriosis and to developing new therapeutic strategies
 
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Publishing Date
2021-10-29
 
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