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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.5.2011.tde-22072011-132252
Document
Author
Full name
Claudia Messias Gomes
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2011
Supervisor
Committee
Baracat, Edmund Chada (President)
Motta, Eduardo Leme Alves
Navarro, Paula Andrea de Albuquerque Salles
Serafini, Paulo Cesar
Soares Júnior, José Maria
Title in Portuguese
Influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas e de mulheres maturados in vitro
Keywords in Portuguese
Criopreservação
Imunocitoquímica
Meiose
Microscopia de luz polarizada
Oócito
Vitrificação
Abstract in Portuguese
Introdução: O fuso meiótico dos oócitos de mamíferos pode se despolimerizar quando exposto a pequenas variações de temperatura. Este fato já está bem estabelecido e estudado em oócitos maduros em metáfase II (MII). No entanto, pouco se sabe a respeito da influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico dos oócitos imaturos. Desse modo, este estudo tem como objetivos: 1) avaliar a influência da diminuição da temperatura sobre o fuso meiótico de oócitos de camundongas maturados in vitro e 2) avaliar o fuso meiótico em oócitos humanos maturados in vitro submetidos à criopreservação pela técnica de congelação lenta ou por vitrificação quando em estágio de vesícula germinativa. Métodos: Realizaram-se dois experimentos, denominados 1 e 2, sendo o primeiro em oócitos de camundongas e o segundo em oócitos humanos. No experimento 1 oócitos imaturos de camundongas nos estágios de metáfase I (MI), telófase I(TI) e MII foram cultivados nas seguintes temperaturas: 37º C (controle), temperatura ambiente (22oC) e 4º C por 0, 10, 30 e 60 minutos. Após este período de tempo o fuso meiótico oocitário foi avaliado por meio de microscopia de luz polarizada (MLP) (LC-Polscope-Oosight image software) e imunocitoquímica (IC). No experimento 2 oócitos em estágio de vesícula germinativa (GV) coletados de pacientes submetidas à indução da ovulação e fertilização in vitro, foram divididos de forma randômica em três grupos: oócitos a fresco (A), oócitos congelados pela técnica de congelação lenta (B) e oócitos congelados pela técnica de vitrificação (C). Os oócitos a fresco, os descongelados e os aquecidos foram maturados in vitro até estágio de (MII). A análise do fuso meiótico foi realizada por microscópio invertido equipado com uma câmera de vídeo analógica e um sistema de imagens que combina luz polarizada em cristal líquido (ICSI Guard Octax). Resultados: Experimento 1: No tempo 0 e à 37º C, todos os oócitos apresentavam o fuso meiótico visível tanto pela MLP quanto pela IC. À 4º C, o número de oócitos em MI com fuso meiótico visível por meio da MLP foi menor do que com a IC, e descresceu com o tempo, fato que também ocorreu, em menor proporção, com os oócitos em TI. No entanto, a 4º C, o reconhecimento do fuso meiótico dos oócitos em TI foi semelhante tanto para MLP como para IC. Quando os oócitos MII foram expostos à 4º C, a detecção do fuso meiótico teve descréscimo diretamente proporcional ao tempo de cultura quando foi utilizada a MLP, sendo que o mesmo ocorreu para a IC, porém de forma menos pronunciada. À temperatura ambiente houve um pequeno descéscimo na visualização do fuso meiótico tanto por MLP quanto por IC, porém este não foi estatisticamente significativo para os oócitos em TI. Experimento 2: A taxa de sobrevivência imediatamente após o descongelamento/ aquecimento foi de 44,6% para o grupo B e de 79% para o grupo C. Após 24 horas em cultura , estas taxas passaram para 29,2% e 69%, respectivamente. A mediana de tempo para maturação foi de 26 horas para os grupos A e C, e de 27 horas para o grupo B. Ao final da maturação in vitro a porcentagem de oócitos em MII foi menor no grupo B e semelhante nos grupos A e C. Assim como para a detecção do fuso meiótico que foi menor no grupo B e similar nos grupos A e C. Conclusões: Houve diferença na porcentagem de despolimerização do fuso meiótico em resposta à baixa temperatura entre os oócitos de camundongas nos diferentes estágios da divisão meiótica, sendo menor nos oócitos em TI. A porcentagem de despolimerização do fuso meiótico foi diretamente proporcional ao tempo de cultivo, à exceção dos oócitos em TI à temperatura ambiente. Os oócitos hmanos em GV vitrificados apresentaram melhores taxas de sobrevivência quando comparados com oócitos humanos em GV criopreservados pelo congelamento lento. Os oócitos humanos em GV vitrificados apresentaram taxas semelhantes de maturação in vitro e detecção do fuso meiótico polimerizado quando comparados a oócitos a fresco
Title in English
Low temperature influence on meiotic oocyte spindle of mice and humans after maturation in vitro
Keywords in English
Cryopreservation
Immunocytochemistry
Meiosis
Oocyte
Polarized light microscopy
Vitrification
Abstract in English
Introduction: The meiotic spindle of most mammals is sensitive to cooling and depolymerizes even after a slight reduction in temperature. This is well described and studied on matured oocytes at metaphase II (MII). However, little is known about the influence of low temperatures under meiotic spindle of imature oocytes. In this way, we sougth to evaluate: 1) the influence of low temperatures on mice oocyte meiotic spindle matured in vitro e 2) the oocyte meiotic spindle from human oocytes matured in vitro and cryopreserved by slow-rate freezing or vitrification at GV stage. Methods: Two experiments were done: the first one on mice and the second one on women.At experiment 1, immature mice oocytes at metaphase I (MI), telophase I (TI) and MII were cultured at 37º C (control), room temperature (22oC) and 4º C for 0, 10, 30 and 60 minutes and then spindle analysis was made with polarized light microscopy (PLM) (LC-Polscope-Oosight image software) or immunocytochemistry (ICC). At experiment 2, GV oocytes retrieved from women submitted to ovulation induction and in vitro fertilization were randomly divided in three groups: fresh oocytes (A), cryopreserved by slow-freezing (B) and cryopreserved by vitrification (C). Fresh, thawed and warmed oocytes were matured in vitro to metaphase II oocytes (MII). A meiotic spindle analysis was done by polarized light microscopy (ICSI Guard Octax). Results: Experiment 1: At time 0 min and 37º C, all oocytes had polymerized spindles both at PLM or ICC. At 4º C, the number of MI oocytes with detectable spindles at PLM was smaller than those analysed by ICC, and it decreased with time, which had also occured with TI oocytes at a smaller proportion. However, at 4º C, TI meiotic spindle recognition with polarized light microscopy and ICC was comparable. When MII oocytes were cultured at 4º C, the spindle visualization decreased proportionally in correlation with culture time at PLM, and the same happened with ICC in a less pronounced manner. At room temperature there was a little descrease regarding visualization of meiotic spindle, both at PLM and ICC, altought it was not significant for TI oocytes. Experiment 2: Oocyte survival immediately after thawing/warming were 44.6% for group B and 79% for group C. After 24 hours of culture, oocyte survival was 29.2% and 69%, respectively. The median time for maturation was 26 hours for groups A and C, and 27 hours for group B. The percentage of MII after maturation in vitro were smaller in group B and similar between groups A and C. The same oocured for spindle visualization which were lower in group B and similar between groups A and C. Conclusions: There was a difference on the percentages of meiotic spindle depolymerization in response to cooling in mice oocytes at different stages of meiotic division. Spindle depolymerization was lower in TI. Also, meiotic spindle depolimerization was proportional to culture time, except for TI oocytes at room temperature.Vitrified GV oocytes had a better survival when warmed, compared to slow-rate frozen oocytes. Vitrified GV oocytes had similar maturation in vitro rates and polymerized spindles detection when compared to fresh oocytes
 
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Publishing Date
2011-07-25
 
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