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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2020.tde-14062021-085228
Documento
Autor
Nombre completo
Marcos Eiji Shiroma
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2020
Director
Título en portugués
Efeitos da melatonina na criopreservação do tecido ovariano
Resumen en portugués
INTRODUÇÃO: Os avanços no tratamento de câncer possibilitaram maior sobrevida às pacientes. Consequentemente, novas técnicas que permitam a manutenção da fertilidade dessas mulheres são estudadas e algumas permanecem em caráter experimental, como o transplante de ovário, que ainda apresenta limitações na qualidade do tecido criopreservado depois do descongelamento. A melatonina é uma indolamina com potente propriedade anti-oxidante cujos efeitos tem sido estudados em transplante de diversos órgãos. OBJETIVO: Avaliar os efeitos da melatonina na criopreservação do tecido ovariano de ratas: avaliação funcional pela retomada do ciclo estral após transplante; macroscopia, histomorfometria e imunoistoquímica do enxerto. MATERIAIS E MÉTODOS: Vinte e seis ratas Wistar adultas, com cerca de três meses de idade e ciclos estrais regulares foram distribuídas, randomicamente, em dois grupos com 13 animais em cada: 1) grupo controle: ovários criopreservados com meio M2 de cultura celular e crioprotetor dimetilsulfóxido (DMSO); e 2) grupo melatonina: ovários criopreservados com meio M2, DMSO e melatonina. Os ovários foram mantidos em nitrogênio líquido por 24h e, em seguida, realizou-se transplante autólogo e avascular dos ovários íntegros em retroperitônio. Em outros três animais de cada grupo, os ovários foram analisados imediatamente após o descongelamento, para avaliar os possíveis efeitos causados pela criopreservação. A partir do 15o dia de pós-operatório (PO), coletaram-se esfregaços vaginais diários corados pela técnica de Shorr-Harris para caracterização do ciclo estral. Entre o 30o e 35o dia de PO, os animais foram submetidos à eutanásia sempre na fase diestro do ciclo estral. Os enxertos ovarianos foram identificados, ressecados e armazenados. Realizaram-se as seguintes análises: 1) histomorfológica; 2) histomorfométrica (classificação e contagem de folículos ovarianos e corpos lúteos); 3) quantificação de colágeno no estroma do ovário (Picrosirius); 4) imunoistoquímica para proliferação celular (Ki-67), apoptose (caspase-3 clivada, TUNEL), angiogênese (fator - von Willebrand) e expressão hormonal (receptor para estrogênio e progesterona). RESULTADOS: No grupo de ratas cujos enxertos ovarianos foram analisados logo após o descongelamento, não se observou diferença estatisticamente significativa do grupo melatonina em relação ao controle com relação a folículos imaturos (4,66 ± 0,88 x 10,33 ± 2,90; p=0,13), folículos maduros (5,33 ± 1,20 x 11,00 ± 3,51; p=0,20), corpos lúteos (10,33 ± 4,70 x 10,00 ± 3,46; p=0,95), vasos sanguíneos (2,66 ± 1,76 x 4,66 ± 1,45; p=0,43), expressão de caspase em estroma (1,95 ± 0,33 x 1,61 ± 0,32; p=0,48), caspase em folículos (2,37 ± 0,33 x 3,39 ± 0,75; p=0,18), TUNEL em estroma (0,21 ± 0,09 x 0,05 ± 0,01; p=0,05) e TUNEL em folículos (0,07 ± 0,01 x 0,04 ± 0,01; p=0,26). No grupo de ratas cujos enxertos ovarianos foram analisados após 30 a 35 dias do transplante, todos os animais apresentaram fase estral do ciclo estral, sendo mais precoce no grupo melatonina (16,22 ± 0,50 x 20,75 ± 1,89; p=0,0017). Os folículos ovarianos viáveis estavam em diversos estágios de desenvolvimento e os corpos lúteos, intactos. O grupo melatonina, em relação ao grupo controle, apresentou aumento em: folículos maduros (8,75 ± 2,02 x 3,01 ± 0,91; p=0,04), colágeno tipo I (8,52 ± 1,04 x 5,75 ± 0,52; p=0,03), células endoteliais (fator de von Willebrand) (3,20 ± 0,38 x 1,69 ± 0,28; p=0,003), proliferação celular por Ki67 tanto em folículos (4,09 ± 0,55 x 1,46 ± 0,29; p=0,002) como corpos lúteos (5,27 ± 0,54 x 1,67 ± 0,33; p < 0,001), receptores de estrogênio em folículos (5,37 ± 0,73 x 2,41 ± 0,93; p=0,02), corpos lúteos (6,43 ± 0,85 x 2,25 ± 0,38; p < 0,001) e apoptose por caspase em corpos lúteos (24,50 ± 2,06 x 5,88 ± 0,82; p < 0,001). O grupo melatonina, em relação ao controle, revelou redução em colágeno tipo III (1,49 ± 0,15 x 3,53 ± 0,28; p < 0,001) e apoptose pelo método TUNEL em folículos (0,04 ± 0,02 x 0,40 ± 0,14; p < 0,001) e corpos lúteos (0,10 ± 0,03 x 1,58 ± 0,23; p < 0,001). Não houve diferença estatisticamente significativa no grupo melatonina em relação ao controle em número de folículos imaturos (6,00 ± 2,55 x 7,20 ± 3,23; p=0,66), corpos lúteos (5,22 ± 1,05 x 7,86 ± 1,71; p=0,34) e apoptose representada pela caspase 3 clivada em folículos (13,70 ± 1,79 x 11,30 ± 1,87; p=0,38) nem em receptores de progesterona em folículos (4,65 ± 1,13 x 4,26 ± 0,53; p=0,77) ou corpos lúteos (13,47 ± 1,72 x 16,62 ± 1,07; p=0,14). CONCLUSÃO: O emprego da melatonina na solução de criopreservação aparenta melhorar a qualidade do tecido ovariano preservado, em parâmetros funcionais, histológicos e imunoistoquímicos
Título en inglés
Melatonin effects on ovarian tissue cryopreservation
Resumen en inglés
INTRODUCTION: Advances in cancer treatment have allowed young patients to enjoy longer survival. Consequently, new techniques enabling fertility maintenance in such young women have been studied in experimental environments. Also, cryopreservation has still some limitations in the quality of ovarian tissue after thawing. Melatonin is an indolamine with potent anti-oxidant properties that have been studied in different organs transplantation. OBJECTIVE: the aim of this study was to analyze cryopreserved rat ovarian grafts with melatonin added to the culture medium: functional evaluation by estrous cycle restart after transplantation; macroscopy, histomorphometry and immunohistochemical analysis of the graft. MATERIALS AND METHODS: Twenty out of 26 adult female Wistar rats, aged approximately three months with regular estrous cycles, were allocated to two study groups of 10 animals each: 1) control group: cryopreserved ovaries in M2 culture medium, dimethyl sulfoxide (DMSO); and 2) melatonin group: cryopreserved ovaries in M2 culture medium, DMSO, and melatonin. Following a 24-hour immersion in liquid nitrogen, the whole ovaries underwent an autologous and avascular transplant with retroperitoneal placement. After postoperative (PO) day 15, daily vaginal smears were collected and stained by the Shorr-Harris technique for estrous cycle characterization. Between PO day 30 and 35, the animals were euthanized always in diestrus. The ovarian grafts were identified, dried, and stored. The following analyses were carried out: 1) histomorphology; 2) histomorphometry: classification and counting of ovarian follicles and corpora lutea; 3) quantification of collagen in ovarian stroma (Picrosirius); 4) immunohistochemistry for cell proliferation (Ki-67), apoptosis (cleaved caspase 3, TUNEL), angiogenesis (factor -von Willebrand factor) and hormonal expression (estrogen and progesterone receptors). The three remaining rats from each group had their ovaries analyzed immediately after thawing so as to determine the cryopreservation effects. RESULTS: In the group of rats whose ovarian grafts were analyzed shortly after thawing, no statistically significant difference was observed between the melatonin group and the control group regarding immature follicles (4,66 ± 0,88 x 10,33 ± 2,90; p=0,13), mature follicles (5,33 ± 1,20 x 11,00 ± 3,51; p=0,20), corpora lutea (10,33 ± 4,70 x 10,00 ± 3,46; p=0,95), blood vessels (2,66 ± 1,76 x 4,66 ± 1,45; p=0,43), caspase expression in stroma (1,95 ± 0,33 x 1,61 ± 0,32; p=0,48), caspase in follicles (2,37 ± 0,33 x 3,39 ± 0,75; p=0,18), TUNEL in stroma (0,21 ± 0,09 x 0,05 ± 0,01; p=0,05) and TUNEL in follicles (0,07 ± 0,01 x 0,04 ± 0,01; p=0,26). In the group of rats whose ovarian grafts were analyzed 30 to 35 days after transplantation, all animals presented estrous phase of the estrous cycle, being more precocious in the melatonin group. (16,22 ± 0,50 x 20,75 ± 1,89; p=0,0017). Viable ovarian follicles were obtained in several stages of development and intact, and functioning corpora lutea. The use of melatonin, in comparison to control, promoted an increase in: mature follicles (8,75 ± 2,02 x 3,01 ± 0,91; p=0,04), collagen type I (8,52 ± 1,04 x 5,75 ± 0,52; p=0,03), endothelial cells (von Willebrand factor) (3,19 ± 0,38 x 1,69 ± 0,28; p=0,003), cellular proliferation (Ki67) both in follicles (4,09 ± 0,55 x 1,46 ± 0,29; p=0,002) and corpora lutea (5,27 ± 0,54 x 1,67 ± 0,33; p < 0,001), estrogen receptors in follicles (5,37 ± 0,73 x 2,41 ± 0,93; p=0,02) and corpora lutea (6,43 ± 0,85 x 2,25 ± 0,38; p < 0,001), and apoptosis by clived caspase 3 in corpora lutea (24,50 ± 2,06 x 5,88 ± 0,82; p < 0,001). In the melatonin group, compared to control, there was reduction on collagen type III (1,49 ± 0,15 x 3,53 ± 0,28; p<0,001) and apoptosis by TUNEL on follicles (0,04 ± 0,02 x 0,40 ± 0,14; p < 0,001) and corpora lutea (0,10 ± 0,03 x 1,58 ± 0,23; p < 0,001). Melatonin group, compared to control, showed no statistically significant difference on number of immature follicles (6,00 ± 2,55 x 7,20 ± 3,23; p=0,66), corpora lutea (5,22 ± 1,05 x 7,86 ± 1,71; p=0,34) and apoptosis by caspase on follicles (13,70 ± 1,79 x 11,30 ± 1,87; p=0,38) and progesterone receptor on follicles (4,65 ± 1,13 x 4,26 ± 0,53; p=0,77) or corpora lutea (13,47 ± 1,72 x 16,62 ± 1,07; p=0,14). CONCLUSION: The use of melatonin in cryopreservation solution seems to improve the quality of preserved ovarian tissue, in functional, histological and immunohistochemical parameters
 
Fecha de Publicación
2021-06-14
 
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CeTI-SC/STI
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