Os astrocitomas, são tumores que se originam das células astrocíticas do sistema nervoso central. Os astrocitomas foram classificados pela Organização Mundial da Saúde com base na malignidade, considerando características histológicas. Recentemente, essa classificação foi incluiu características moleculares, como mutações e outras alterações cromossômicas. O glioblastoma (GBM), categorizado como grau 4 entre os astrocitomas difusos e caracterizado por IDH selvagem, é o glioma mais prevalente e apresenta o prognóstico mais desfavorável. Com o intuito compreender os processos de gliomagênese, nosso laboratório realizou uma comparação dos genes mais expressos no GBM em relação ao astrocitoma grau 1, visando potenciais alvos terapêuticos. O gene responsável pela codificação da enzima lisil oxidase (LOX) foi identificado com uma expressão elevada no GBM. Esta enzima faz parte de uma família composta por cinco membros - LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4 - desempenhando um papel crucial na catalisação das ligações cruzadas do colágeno e da elastina. Sua atuação é essencial para conferir rigidez à matriz extracelular (MEC). Neste presente estudo, foram realizadas análises para compreender melhor o papel de LOXL3 em astrocitomas. Análises in silico mostraram que LOXL3 é altamente expresso em GBM, com maior expressão no subtipo molecular de pior prognóstico, o mesenquimal. Além disso, a expressão de LOXL3 influenciou no prognóstico dos pacientes com GBM. Pacientes com maior expressão de LOXL3 apresentaram menor sobrevida do que àqueles com menor expressão do gene. O silenciamento transitório de LOXL3 na linhagem celular de GBM humano U87MG levou a uma diminuição da proliferação, adesão e invasão celular, e um aumento de apoptose e da superfície celular. Análises de transcriptoma mostraram um aumento da expressão de genes que codificam proteínas relacionadas a MEC, adesão celular, e componentes do citoesqueleto. Análises in sílico no banco de dados do TCGA mostraram correlação dos níveis de expressão de LOXL3 e de genes que codificam tubulinas no subtipo mesenquimal. A expressão dos genes da família LOX aumenta de acordo com malignidade dos astrocitomas. Com base na influência de LOXL3 na estabilidade da MEC, foram realizadas análises in silico em banco de dados públicos para avaliar a correlação dos genes da família LOX e os que codificam componentes da MEC nos astrocitomas diferentes graus de malignidade e com e sem mutação de IDH. Foi observado um aumento progressivo na expressão dos cinco membros da família LOX conforme o aumenta o grau de malignidade. Os níveis de expressão de LOX, LOXL1 e LOXL3 correlacionaram-se positivamente com os de genes do matrissoma. Foram observadas correlações específicas, como LOXL1 em gliomas de baixo grau (LGG) com mutação no IDH (IDHmut), LOXL3 em LGG com tipo selvagem de IDH (IDHwt) e forte correlação de LOX em GBM. Essas associações podem explicar o aumento na rigidez da MEC e na agressividade tumoral de LGG-IDHmut para LGG-IDHwt até GBM. Além disso, a expressão do fator de transcrição sensível à mecanotransdução, -catenina, aumentou com o grau de malignidade e correlacionou-se com LOXL1 e LOXL3, sugerindo seu envolvimento na via de sinalização. Para dar continuidade a análises do papel funcional de LOXL3 em GBMs, foi realizado um nocaute gênico através do sistema de CRISPR-Cas9 nas linhagens celulares de GBM humano, U87MG e U251. A análise do transcriptoma mostrou uma diminuição de expressão de genes relacionados à acetilação da tubulina nas células U87MG, confirmada por Western blot, corroborando com as correlações observadas anteriormente em análises in silico. Além disso, observou-se uma redução de expressão de genes ligados ao ciclo celular em ambas as linhagens celulares. Também foram observados através de ensaios funcionais atraso na progressão do ciclo celular e alterações marcantes no fuso mitótico durante as fases de metáfase-anáfase. A análise da morfologia nuclear indicou alterações associadas à catástrofe mitótica em células U87MG e à senescência em células U251. Corroborando com dados obtidos anteriormente, observou-se uma diminuição nos processos de adesão e migração celular nas células nocauteados para LOXL3. A análise do banco de dados do TCGA revelou uma correlação entre a expressão do LOXL3 e genes relacionados ao ciclo celular, morte celular e senescência em casos GBM com TP53 mutado. Além disto, observou-se que a coexpressão de LOXL3 e CCNE1 impactou a sobrevivência de pacientes com GBM com mutação no TP53, sugerindo um potencial alvo terapêutico combinado para casos de GBM com essa mutação. Esses dados corroboram para descrever o papel funcional de LOXL3 em GBM envolvendo a organização do citoesqueleto, principalmente relacionado a tubulina e microtúbulos. Ainda, LOXL3 está relacionado a processos como invasão tumoral e rigidez da MEC. Esses resultados sugerem a relevância de LOXL3 nos astrocitomas, reforçando que pode ser um potencial alvo terapêutico

Astrocytomas are tumors originating from the astrocytic cells of the central nervous system. The World Health Organization has classified astrocytomas based on malignancy, considering histological characteristics. Recently, this classification has incorporated molecular features such as mutations and chromosomal alterations. Glioblastoma (GBM), categorized as grade 4 among diffuse astrocytomas and characterized by wild-type IDH, is the most prevalent glioma with the poorest prognosis. In order to understand gliomagenesis processes, our laboratory compared the most expressed genes in GBM to grade 1 astrocytoma, aiming to identify potential therapeutic targets. The gene encoding the lysyl oxidase enzyme (LOX) was identified with elevated expression in GBM. This enzyme, part of a family of five membersLOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3, and LOXL4plays a crucial role in catalyzing collagen and elastin cross-linking, essential for conferring stiffness to the extracellular matrix (ECM). In this study, analyses were conducted to better understand the role of LOXL3 in astrocytomas. In silico analyses showed that LOXL3 is highly expressed in GBM, with higher expression in the mesenchymal molecular subtype associated with worse prognosis. Furthermore, LOXL3 expression influenced the prognosis of GBM patients, with higher LOXL3 expression correlating with reduced survival. Transient silencing of LOXL3 in the human GBM cell line U87MG resulted in decreased cell proliferation, adhesion, and invasion, increased apoptosis, and altered cell surface characteristics. Transcriptome analyses revealed increased expression of genes encoding ECM-related proteins, cell adhesion, and cytoskeletal components. In silico analyses using TCGA database showed a correlation between LOXL3 expression and tubulin-encoding genes in the mesenchymal subtype. The expression of LOX family genes increased with astrocytoma malignancy. Based on LOXL3's influence on ECM stability, in silico analyses were performed on public databases to assess the correlation between LOX family genes and those encoding ECM components in astrocytomas of different malignancy grades and with or without IDH mutation. A progressive increase in the expression of all five LOX family members was observed with increasing malignancy grade. LOX, LOXL1, and LOXL3 expression positively correlated with matrisome genes. Specific correlations were noted, such as LOXL1 in low-grade gliomas (LGG) with IDH mutation (IDHmut), LOXL3 in LGG with wild-type IDH (IDHwt), and a strong correlation of LOX in GBM. These associations may explain the increased ECM stiffness and tumor aggressiveness from LGG-IDHmut to LGG-IDHwt to GBM. Additionally, the expression of the mechanotransduction-sensitive transcription factor -catenin increased with malignancy grade and correlated with LOXL1 and LOXL3, suggesting its involvement in signaling pathways. To further analyze the functional role of LOXL3 in GBMs, CRISPR-Cas9 gene knockout was performed in the human GBM cell lines U87MG and U251. Transcriptome analysis revealed a decrease in tubulin acetylation-related gene expression in U87MG cells, confirmed by Western blot, supporting previous in silico correlations. Moreover, a reduction in the expression of cell cycle-related genes was observed in both cell lines. Functional assays demonstrated delayed cell cycle progression and significant alterations in the mitotic spindle during metaphase-anaphase phases. Nuclear morphology analysis indicated changes associated with mitotic catastrophe in U87MG cells and senescence in U251 cells. Consistent with previous data, knockdown of LOXL3 resulted in decreased cell adhesion and migration processes. TCGA database analysis revealed a correlation between LOXL3 expression and genes related to cell cycle, cell death, and senescence in GBM cases with mutated TP53. Furthermore, coexpression of LOXL3 and CCNE1 impacted the survival of GBM patients with TP53 mutation, suggesting a potential combined therapeutic target for such cases. These findings contribute to describing the functional role of LOXL3 in GBM, involving cytoskeleton organization, particularly related to tubulin and microtubules. Additionally, LOXL3 is associated with processes such as tumor invasion and ECM stiffness. These results suggest the relevance of LOXL3 in astrocytomas, emphasizing its potential as a therapeutic target