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Master's Dissertation
DOI
Document
Author
Full name
Talita de Sousa Laurentino
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2019
Supervisor
Committee
Shinjo, Sueli Mieko Oba (President)
Silva, Roseli da
Costa, Erico Tosoni
Giannella, Maria Lucia Cardillo Correa
Title in Portuguese
Análise funcional da enzima LOXL3 em astrocitomas
Keywords in Portuguese
Apoptose
Astrocitoma
Glioblastoma
Lisil oxidase
Lisil oxidase tipo 3
Mitocôndrias
Proliferação de células
Abstract in Portuguese
Os astrocitomas são neoplasias originadas das células astrocíticas do sistema nervoso central e são os tumores mais frequentes dentre os gliomas (tumores associados às células gliais). Inicialmente, a Organização Mundial de Saúde classificou os astrocitomas de acordo com a malignidade, levando em conta características histológicas (astrocitomas de grau I a IV). Entretanto, recentemente, características moleculares, como mutações e outras alterações cromossômicas, foram incorporada à classificação. O glioblastoma (GBM), grau IV, é o mais comum dos gliomas e com o pior prognóstico. Para melhor compreensão do processo de gliomagênese, nosso laboratório comparou os genes com maior expressão em GBM em relação ao astrocitoma grau I, com o objetivo de identificar novos alvos terapêuticos. O gene que codifica a enzima lisil oxidase (LOX) foi um dos que apresentaram maior expressão em GBM. A enzima LOX pertence a uma família com cinco membros, LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 e LOXL4, e atua na catalisação das ligações cruzadas do colágeno e da elastina, desempenhando importante papel na rigidez da matriz extracelular. Dentre os membros da família LOX, a expressão de LOXL3 influenciou no prognóstico dos casos com GBM: Pacientes com maior expressão apresentaram uma menor média da sobrevida em relação aos que apresentaram menor expressão do gene. No presente estudo, foi realizado o silenciamento gênico transitório de LOXL3 com duas sequências de siRNA em linhagem celular de GBM U87MG. A eficiência do silenciamento de LOXL3 para siRNA1 e siRNA2 foi de 84,7% e 50,9% respectivamente em nível de RNA, e 41,5% e 39,2% respectivamente em nível de proteína em relação ao controle. Em ensaios funcionais, o silenciamento de LOXL3 levou a uma diminuição da proliferação celular (36,9% e 26,2% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente), além de um aumento de apoptose sem (13,43% e 7,04% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente) e com (32,8% e 24,64% para o siRNA1 e siRNA2, respectivamente) tratamento com temozolamida. Além disso, foi demonstrado por imunofluorescência que LOXL3 colocalizou com as mitocôndrias nas células U87MG. Adicionalmente à colocalização, as células com silenciamento de LOXL3 apresentaram um aumento da fluorescência do marcador mitocondrial 5 vezes maior que o controle, além do aumento no número de cópias do DNA mitocondrial de 18,24% para o siRNA1. Ainda, análises de RNA-seq mostraram que células U87MG com silenciamento de LOXL3 apresentaram uma diminuição da expressão de genes relacionados no processo relacionado com fluxo autofágico e fissão mitocondrial sugerindo que LOXL3 possivelmente desempenhe um papel no processo de autofagia/mitofagia. Além disso, genes relacionados com a via de replicação do mtDNA também apresentaram um aumento da expressão. Adicionalmente, genes relacionados com a via de apoptose, também apresentaram uma hiperexpressão, corroborando com os ensaios funcionais realizados. Portanto, o silenciamento transitório de LOXL3 na linhagem celular U87MG promoveu uma diminuição da viabilidade celular, e consequentemente um aumento do nível de apoptose. Além disso, LOXL3 colocalizou com as mitocôndrias na célula U87MG. Baixa expressão de LOXL3 promoveu um aumento da fluorescência do marcador mitocondrial, e adicionalmente, o número de cópias do DNA mitocondrial apresentou um aumento em comparação com o controle. Este trabalho sugere que LOXL3 pode estar envolvido com o processo de dinâmica mitocondrial, favorecendo o a via de autofagia/mitofagia, e inibindo a morte celular na linhagem U87MG. Não há trabalhos anteriores que descrevem o papel de LOXL3 em astrocitomas e nem o envolvimento com mitocôndrias e autofagia e/ou mitofagia. Os dados obtidos no presente trabalho sugerem um novo papel de LOXL3 em astrocitomas
Title in English
The functional role of LOXL3 in astrocytomas
Keywords in English
Apoptosis
Astrocytoma
Cell Proliferation
Glioblastoma
Lysyl oxidase
Lysyl oxidase like 3
Mitochondria
Abstract in English
Astrocytomas are neoplasms originated from astrocytic cells of the central nervous system and are the most common tumors among gliomas (glial cell tumors). Initially, the World Health Organization classified astrocytomas according to malignancy, taking into account histological characteristics (astrocytomas of grade I to IV). However, recently, molecular characteristics such as mutations and other chromosomal alterations have been incorporated into the classification. Glioblastoma (GBM), grade IV, is the most common glioma and with the worst prognosis. For a better understanding of gliomagenesis process, our laboratory compared genes with greater expression in GBM in relation to grade I astrocytoma, in order to identify new therapeutic targets. The gene that codes for the enzyme lysyl oxidase (LOX) was one of the genes with higher expression in GBM. The LOX enzyme belongs to a family with five members, LOX, LOXL1, LOXL2, LOXL3 and LOXL4, and acts on the catalysis of crosslinks of collagen and elastin, playing an important role in the stiffness of the extracellular matrix. Among the LOX family members, LOXL3 expression influenced on the prognosis of GBM cases: patients with higher LOXL3 expression had a lower mean survival rate than those with the lowest LOXL3 expression. In the present study, transient LOXL3 silencing with two siRNA sequences was performed in the GBM U87MG cell line. The knock down efficiency of LOXL3 for siRNA1 and siRNA2 was 84.70% and 50.9% respectively at the transcript level, and 41.5% and 39.2%, respectively, at the protein level in relation to the control. In functional assays, LOXL3 silencing promoted a decrease in cell proliferation (36.9% and 26.2% for siRNA1 siRNA2, respectively), as well as an increase in apoptosis without (13.43% and 7.04% for the siRNA1 siRNA2, respectively) and with (32.8% and 24.64% for the siRNA1 siRNA2, respectively) treatment with temozolomide. Moreover, it was also demonstrated by immunofluorescence that LOXL3 colocalized with mitochondria in U87MG cells. In addition to the colocalization, cells with LOXL3 silencing showed an increase in mitochondrial marker fluorescence 5-fold higher than the control cells. Moreover, cells with LOXL3 knock down had an increase in the number of mitochondrial DNA copy number of 18.24% for siRNA1. Furthermore, RNA-seq analysis showed that U87MG cells with LOXL3 knock down had a decrease in the expression of genes related to the process related to autophagic flux, suggesting that LOXL3 probably plays a role in the autophagy/mitophagy process. In addition, genes related to mtDNA replication are also an increase in expression. Additionally, genes related to the apoptosis pathway are also overexpressed, corroborating the data obtained. Therefore, transient silencing of LOXL3 in the U87MG cell line promoted a decrease in cell viability, and consequently an increase in apoptosis level. In addition, LOXL3 colocalized with mitochondria in the U87MG cell. Low LOXL3 expression promotes increased mitochondrial marker fluorescence and, additionally, mitochondrial DNA copy number exhibits an increase compared to control. This work suggests that LOXL3 may be involved with the mitochondrial dynamics process, favoring the autophagy / mitophagy pathway, and inhibiting cell death in the U87MG strain. There are no papers that describe the role of LOXL3 in astrocytomas and neither the involvement with mitochondria and autophagy and / or mitophagy. However, there is no paper that has described the role of LOXL3 in astrocytomas and neither its involvement with mitochondria and autophagy and/or mitophagy. Our data suggest a new role of LOXL3 in astrocytomas
 
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Publishing Date
2019-11-11
 
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