INTRODUÇÃO: A complexidade do diagnóstico molecular do hipopituitarismo destaca se na diversidade fenotípica e na variabilidade genética associada à doença. A recente descoberta de variantes sinônimas no gene HESX1 representa um desafio adicional, enfatizando a necessidade de mais investigações. Neste estudo reexaminamos dados de sequenciamento, previamente realizados no laboratório de hormônios ( LIM 42 )), priorizando a detecção de variantes sinônimas para associação com o fenótipo dos pacientes, contribuindo para uma compreensão mais abrangente do hipopituitarismo e refinamento das estratégias diagnósticas. MATERIAIS E MÉTODOS: Dos 218 pacientes incluídos no estudo, 166 foram sequenciados em painel ou exoma, enquanto 51 foram submetidos ao sequenciamento Sanger. As sequências do painel ou exoma foram avaliadas na plataforma Franklin e as sequências Sanger fo ram verificadas manualmente. As variantes sinônimas identificadas foram confirmadas in silico , considerando MAF <1%, utilizando ferramentas como ABraOM, 1 000G e gnomAD. Para avaliar resultados em regiões de splicing foram utilizados SpliceAI e dbscSNV Ada, com estudo in vitro utilizando primers para amplificação e sequenciamento específico do gene HESX1 em cDNA. RESULTADOS: Evidenciaram se 3 variantes em 22 pacientes, 2 consideradas polimorfismos c.374A>G (p.N125S), c.385G>A (p.V129I). A variante c.460 3T>C, intrônica e na região de splicing , foi encontrada em heterozigosidade em apenas 1 paciente, que também era portador da variante c.374A>G (p.N125S). A avaliação in silico da variante c.460 3T>C indicou MAF <1%, mas com baixa probabilidade de impacto no splicing . O estudo in vitro não mostrou alterações no splicing do cDNA no pai, que é portador da variante, nem no paciente afetado. CONCLUSÃO: A reanálise das sequências do gene HESX1 não evidenciou variantes sinônimas, mas revelou variantes missense e intrônicas sem correlação genótipo fenótipo após validação in silico e experimental.

INTRODUCTION: The complexity of molecular diagnosis in hypopituitarism is highlighted by the phenotypic diversity and genetic variability associated with the disease. The recent discovery of synonymous variants in the HESX1 gene presents an additional challenge, underscoring the need for further investigations. In this study, we re-examined sequencing data previously conducted in the Hormones and Molecular Genetics Laboratory (LIM-42), prioritizing the detection of synonymous variants for association with patient phenotypes, contributing to a comprehensive understanding of hypopituitarism and refinement of diagnostic strategies. MATERIALS AND METHODS: Out of the 218 patients included in the study, 166 underwent panel or exome sequencing, while 51 underwent Sanger sequencing. Panel or exome sequences were evaluated on the Franklin platform, and Sanger sequences were manually verified. Identified synonymous variants were confirmed in silico, considering MAF <1%, using tools such as ABraOM, 1000G, and gnomAD. To assess results in splicing regions, SpliceAI and dbscSNV Ada were employed, with in vitro studies using primers for amplification and specific sequencing of the HESX1 gene in cDNA. RESULTS: Three variants were identified in 22 patients, with 2 considered polymorphisms, c.374A>G (p.N125S), c.385G>A (p.V129I). The variant c.460-3T>C, intronic and in the splicing region, was found in heterozygosity in only 1 patient, who also carried the variant c.374A>G (p.N125S). In silico evaluation of the c.460-3T>C variant indicated MAF <1% but with a low probability of splicing impact. In vitro studies showed no splicing alterations in the cDNA in the carrier father or the affected patient. CONCLUSION: The reanalysis of HESX1 gene sequences did not find synonymous variants but revealed missense and intronic variants without genotype-phenotype correlation after in silico and experimental validation