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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2020.tde-22072021-142734
Document
Author
Full name
Felipe Martins Elias
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2020
Supervisor
Committee
Domenice, Sorahia (President)
Almeida, Madson Queiroz de
Júnior, Gil Guerra
Ribeiro Filho, Leopoldo Alves
Title in Portuguese
Perfil de expressão plasmática dos microRNAs miR-200c e miR-210 em pacientes portadores de diferenças do desenvolvimento sexual (DDS) 46,XY de causa indeterminada
Keywords in Portuguese
Diagnóstico
Hipospádia
Homeobox 1 de ligação a e-box em dedo de zinco
MicroRNAs
Processamento pós-transcricional do RNA
Transtornos 46 XY do desenvolvimento sexual
Abstract in Portuguese
Introdução: As diferenças do desenvolvimento sexual (DDS) afetam 1:1000-4500 nascidos vivos e são definidos como alterações nas quais o desenvolvimento cromossômico, gonadal ou genital são atípicos. Os pacientes portadores de DDS 46,XY apresentam um amplo espectro fenotípico e muitos apresentam genitália atípica ao nascimento. A avaliação diagnóstica de um paciente portador de DDS inclui dosagens hormonais, estudos radiológicos, citogenéticos e moleculares. Porém, uma porcentagem significativa de pacientes permanece sem etiologia e são classificados como DDS de causa indeterminada. Este fato sugere que mecanismos epigenéticos, i.e., não restritos ao DNA e, portanto, não contemplados por análises moleculares usuais, como sequenciamento tipo Sanger e Exoma, possam desempenhar um papel no seu desenvolvimento. Objetivos: Para melhor avaliar estes casos sem diagnóstico estabelecido, investigou-se neste projeto o perfil de expressão plasmático de microRNAs (miRNAs), pequenos RNAs não codificantes de proteína, que se ligam por complementariedade a região 3 ?UTR de mRNA alvos, bloqueando a síntese proteica. Metodologia: Após análise in silico e da literatura os miRNAs, miR-200c, miR-210, e referências miR-23a e miR-451 foram selecionados. O RNA foi extraído do plasma de pacientes e controles, após análise de hemólise por absorbância em 414nm, com o kit MagMAX mirVana Total RNA (Thermofisher), a reação de RT-qPCR foi realizada com os kits TaqMan Advanced miRNA cDNA e Advanced miRNA Assay (Thermofisher). Os dados foram analisados por ?Ct e 2-??Ct. Pacientes e controles foram divididos em dois grupos, pré-púberes (de acordo com volume testicular <3ml e nível de Testosterona <30ng/dL) e, pós-púberes. Adicionalmente, os pacientes foram subdivididos em 2 subgrupos de acordo com o Escore de Masculinização da genitália Externa (EMS), em pouco virilizados (PVG, índice <5) e moderadamente virilizados (MVG, índice >5). Para análise de expressão por faixa etária os controles foram agrupados da seguinte maneira: 1-12 anos, 13-20 anos, 21-30 anos, 31-40 anos e 41-55 anos. Resultados: A expressão plasmática de miR-200c foi maior nos grupos de 13-20 a 41-55 anos do que no grupo de 1-12 anos (ANOVA p=0.0067). Adicionalmente, todos os grupos com mais de 13 anos tiveram médias individualmente maiores de miR-200c do que o grupo de 1-12 anos (p<0.05). A análise ANOVA dos grupos pós-púberes PVG, MVG e controles mostrou uma significância estatística p=0.0013, revelando uma expressão diferencial de miR-200c entre esses grupos. Em pós-puberes uma maior média de expressão de miR-200c foi observada em MVG, com pós-teste de Tukey entre MVG e PVG de p=0.01. Pacientes pós-púberes tiveram maior expressão de miR-200c do que os pacientes pré- púberes (p=0.0002). Os pacientes pós-púberes PVG apresentaram valores de expressão de miR- 200c semelhantes aos dos controles e DDS 46,XY pré-púberes. Em relação ao miR-210, a análise ANOVA de pós-púberes PVG, MVG e controles mostrou significância estatística de p=0.005, com MVG e PVG apresentando médias de expressão superiores ao grupo controle (p=0.002). O mesmo padrão foi observado em relação ao grupo pré-púberes (p=0.022). Conclusão: Em vários tecidos, uma alça de retrocontrole negativo, no qual o miR-200c inibe a expressão de ZEB1 foi demonstrado e foi associado à modulação da transição epitelial- mesenquimal (EMT). Níveis elevados de ZEB1 associado a baixos níveis de miR-200c foram observados na pele genital de indivíduos adultos do sexo masculino e de ratos com hipospádia, reforçando um papel potencial do miR-200c no desenvolvimento da hipospádia. Nossas descobertas fornecem novas evidências sobre o miR-200c circulante, que pode representar uma nova estratégia para a pesquisa em DDS 46,XY, e contribuir para uma maior compreensão do processo de desenvolvimento da genitália externa masculina.
Title in English
Plasmatic expression profiles of microRNAs miR-200c and miR-210 in patients with differences of sexual development (DSD) 46,XY of unknown etiology
Keywords in English
Diagnosis.
Disorder of sex development 46XY
Hypospadias
MicroRNAs
post-transcriptional
RNA processing
Zinc finger e-box-binding homeobox 1
Abstract in English
Introduction: Differences of Sexual Development (DSD) affect 1: 1000-4500 live births and are defined as changes in which chromosomal, gonadal or genital development are atypical. Patients with 46,XY DDS have a broad phenotypic spectrum and many have atypical genitalia at birth. The diagnostic evaluation of a patient with DSD includes hormonal measurements, radiological, cytogenetic and molecular studies. However, a significant percentage of patients remain without etiology and are classified as DSD of unknown etiology. This fact suggests that epigenetic mechanisms, i.e. not restricted to DNA and, therefore, not contemplated by usual molecular analyzes, such as Sanger and Exoma sequencing, may play a role in its development. Objectives: In order to better evaluate these patients with unknown etiology, this project investigated the plasma expression profile of microRNAs (miRNAs), small non-coding protein RNAs, which bind complementarily to the 3 ?UTR region of target mRNA, blocking the protein synthesis. Methodology: In silico and literature analysis were used to select miRNAs miR-34c, miR-200c, miR-210, and references miR-23a and miR-451. RNA was extracted from the plasma of patients and controls with the MagMAX mirVana Total RNA kit (Thermofisher) after analysis of hemolysis by absorbance at 414 nm. RT-qPCR reaction was performed with the TaqMan Advanced miRNA cDNA and Advanced miRNA Assay kits (Thermofisher). The data were analyzed by ?Ct and 2-??Ct. Patients and controls were divided into two groups, prepubertal (according to testicular volume <3ml and Testosterone level <30ng/dL), and post- pubertal group. Additionally, patients were subdivided into 2 subgroups according to the External Masculinization Score (EMS), into Poorly Virilizated (PVG, score<5) and Moderatly Virilizated (MVG, score>5). For age expression analysis controls were grouped as follows: 1- 12 years, 13-20 years, 21-30 years, 31-40 years and 41-55 years. Results: Plasma expression of miR-200c was higher in the groups aged 13-20 to 41-55 years than in the group aged 1-12 (ANOVA p=0.0067). In addition, all groups over the age of 13 had individually higher averages of miR-200c than the group aged 1-12 (p<0.05). ANOVA analysis of post-pubertal PVG, MVG and controls showed a statistical significance p=0.0013, revealing a differential expression of miR-200c between these groups. The highest mean of miR-200c expression was observed in post pubertal MVG group of patients, the Tukey's post-test between MVG and PVG showed p=0.01. Post pubertal patients had higher miR-200c expression than prepubertal patients (p=0.002). Post pubertal PVG patients showed miR-200c expression values similar to those of prepubertal 46, XY DSD and prepubertal controls. In relation to miR-210, ANOVA analysis of post pubertal PVG, MVG and controls showed statistical significance of p=0.005, with MVG and PVG presenting means of expression superior to the control group (p=0.002). The same pattern was observed in relation to the prepubertal group (p = 0.022). Conclusion: In several tissues, a negative feedback loop in which miR-200c inhibits ZEB1 expression has been demonstrated, and has been associated with modulation of the epithelial-mesenchymal transition (EMT). Elevated levels of ZEB1 associated with low levels of miR-200c have been observed in the genital skin of adult male individuals and rats with hypospadias, reinforcing a potential role of miR-200c in the development of hypospadias. Our findings provide new evidence on circulating miR-200c, which may represent a new strategy for research on 46,XY DSD, and contribute to better understand the development processes of the male external genitalia.
 
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Publishing Date
2021-07-22
 
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