A neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) é uma síndrome genética de herança autossômica dominante que predispõe ao risco aumentado de desenvolvimento de diversos tumores endócrinos e não endócrinos. É causada, principalmente, por mutação germinativa no gene MEN1 (11q13). Outros genes (CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP) foram, posteriormente, relacionados ao fenótipo MEN1 em menos de 5% dos casos negativos para mutação germinativa MEN1. Pacientes com mutação nestes genes ou sem nenhuma mutação germinativa documentada são conhecidos como indivíduos MEN1(-). Nosso grupo de pesquisa padronizou e validou recentemente um mini painel genético baseado em sequenciamento paralelo em larga escala (NGS, Next Generation Sequencing) desenhado a partir de PCR longa (long range PCR) que proporcionou o sequenciamento completo (exons, fronteira intron-exon, regiões intrônicas profundas e região promotora) de todos estes genes simultaneamente (MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 e AIP). Estudos controversos e divergentes não têm sido capazes de documentar correlações entre casos com mutações no gene MEN1 (genótipo) e seu fenótipo. Mais recentemente, vem sendo mais bem delineada uma outra forma de análise de correlação genótipo-fenótipo em MEN1 caracterizada pelas diferenças clínicas e de evolução entre casos com e sem mutação germinativa MEN1. Tem sido demonstrado que indivíduos MEN1(-) tem peculiaridades fenotípicas e evoluções diferentes baseado em estudos com casuísticas limitadas e que não foram plenamente estudadas geneticamente. Neste estudo nós investigamos correlações genótipo-fenótipo em casos-índices clinicamente diagnosticados com MEN1 usando este mini painel de 6 genes baseado em PCR long range. A casuística foi constituída por 143 casos-índices com MEN1, sendo 87 deles portadores de mutação germinativa MEN1 e 56 casos-índices sem mutação germinativa MEN1, detectada por sequenciamento (Sanger/NGS) ou por MLPA (MEN1, CDKN1B/p27Kip1 e AIP). Destes 56 casos-índices, 40 deles eram também negativos para o mini painel NGS. Ao todo, 34 de 48 caraterísticas clínicas avaliadas eram diferentes (p<0,05) na comparação de 87 casos-índices portadores de mutação com 40 indivíduos MEN1(-) e 22 (22/34, 65%; 0,05/34 = p, 0,00147) permaneceram diferentes após correção de Bonferroni (p < 0,00147). Todas as 34 características foram reproduzidas e intensificadas na comparação de 56 MEN1(-) com casos mutados adicionada a associação do diagnóstico < 21 anos com estes últimos. Assim, de 35 características diferentes (p < 0,05), 26 permaneceram diferentes após correção de Bonferroni (p < 0,00142). Todos os pacientes com associações HPT (hiperparatireoidismo primário) 45 anos (a)/PIT (adenoma de hipófise) 30a/dp-NET (tumor neuroendócrino duodenal ou pancreático) 30a (13), HPT/PIT/dp-NET/história familial positiva (15), HPT multiglandular 45a/PIT 30a (9), prolactinoma 30a/história familial positiva (10), com diagnóstico de MEN1 <21y ou documentado com pd-NET multifocal ou com dois tipos de pd-NET ou com NET de timo ou de pulmão tinham mutação germinativa MEN1. Além disso, casos com mutação foram associados com probabilidade significativamente mais elevada de HPT multiglandular (127x), terem 3 tumores relacionados a MEN1 (56x), dp-NETs (41,6x), neoplasias malignas (19x), tumor adrenocortical (7,5x), história familial positiva (6x), sexo masculino (4,7x), prolactinoma (2,8x) e microadenoma de hipófise (2,5x). Em contraste, todos casos-índices diagnosticados com HPT uniglandular >45y eram MEN1(- ) (15). Casos MEN1(-) foram associados com probabilidade aumentada de associação HPT>45a/PIT >30a (30x), acromegalia (18x), HPT/PIT (18x), HPT>45a (16x), MEN1>45a (13x), e PIT>30a (4x). Além disso, durante o seguimento de 10,262±0,79 anos (SE) (8,85-11,67 anos), nenhum caso MEN1(-) foi diagnosticado com um 3o tumor relacionado à MEN1 (0/39 vs. 18/47, 38%; p< 0,0001) ou evoluíram com tumores malignos. De fato, dp-NET foi o 3o tumor mais frequente (12/19; 63,1%) em pacientes com mutação MEN1, seguido de PIT (6/19, 31,6%) e HPT (1/19; 5,3%). A sobrevida relacionada a doença era menor em casos com mutação (p=0,025) uma vez que foram associados com uma taxa mais elevada de mortalidade relacionada à MEN1 (1/56, 1,8% vs. 12/87, 16%; p< 0,0001). Corroborando com isso, nove pacientes foram diagnosticados (7) ou progrediram com dp-NET maligno (2) sendo que um 10o caso foi diagnosticado como NET tímico durante o seguimento. Análise de regressão logística multivariada permitiu a construção de um modelo de probabilidade predita baseado em cinco características clínicas (história familial presente/ausente; 45 anos < idade 45 anos; sexo, três ou dois tumores principais, tumor adrenal) úteis para predizer risco de presença/ausência de mutação MEN1 mediante um dado fenótipo na avaliação inicial de casos-índices diagnosticados clinicamente com MEN1. O uso de um painel NGS avaliando os principais genes associados com MEN1(-) MEN1 possibilitou uma definição mais rigorosa da nossa população garantindo que as MEN1(-) do presente estudo não tinham quaisquer mutações nestes genes conhecidos e fortalece a necessidade de mais estudos para investigar outros genes associados a este fenótipo. Nós discriminamos e refinamos diferenças fenotípicas e de evolução clínica entre casos-índices portadores de mutação germinativa MEN1 e MEN1(-) com ausência de mutações pelo painel de 6 genes. Foi possível reconhecer e revelar o risco isolado e integrado de diversos preditores clínicos de prenunciar tanto a ausência como a presença de mutação que nos permitiu construir um modelo de probabilidade predita de aplicação potencial na prática clínica que necessitará ser validado em outras populações. A análise completa de genes conhecidos pode auxiliar na identificação de casos-índices candidatos para estudos de exomas, discriminar melhor as diferenças de fenótipo entre casos com e sem mutações conhecidas e aperfeiçoar tanto o aconselhamento genético como o manejo clínico, seguimento e tratamento de casos-índices portadores de mutação e de MEN1(-)

Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 (MEN1) is a genetic autosomal dominant syndrome that predisposes to enhanced risk for development of several endocrine and non- endocrine tumors. Its mainly caused by germline mutation at the gene MEN1 (11q13). Other genes (CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 and AIP) were after related with MEN1 phenotype in less than 5% of the negative cases for MEN1 germline mutation. Patients harboring mutations within these genes or with no documented mutation are known as MEN1(-). Our research group recently standardized and validated a mini genetic panel based on large scale parallel sequencing (NGS, Next- Generation Sequencing) designed from Long Range PCR that allowed complete sequencing (exons, intron-exon boundaries, deep intronic regions and promoter regions) of all these genes simultaneously (MEN1, CDKN2B/p15, CDKN2C/p18 CDKN1A/p21, CDKN1B/p27Kip1 and AIP). Divergent results have been systematically published about genotype-phenotype correlation in MEN1, although most part of cases support the absence of such correlation. These studies are mainly based in correlation between patients with MEN1 mutations and their phenotypes. More recently, other way of analysis is being designed for genotype-phenotype correlation in MEN1 characterized by clinical and evolution differences between cases with and without germline MEN1 mutations. It has been demonstrated that MEN1(-) cases have phenotypic peculiarities and different evolutions based on studies with limited casuistic and not fully genetically analyzed. In the present study we investigated genotype-phenotype correlations of index-cases clinically diagnosed with MEN1 submitted to wide genetic analysis by large scale parallel sequencing (NGS) based on Long Range PCR. The casuistic was built by 143 MEN1 index-cases, 87 harboring germline MEN1 mutation and 56 index-cases without germline MEN1 mutation, detected by sequencing (Sanger/NGS) or MLPA (MEN1, CDKN1B/p27Kip1 and AIP). From these 56 MEN1 index-cases, 40 of them were also negative for mutation for genetic mini panel. Overall, 34 clinical characteristics were distinct (p<0.05) comparing 87 MEN1 mutation-positive index-cases with 40 MEN1(-) and 22 of them (22/34, 65%; 0.05/34 = p, 0.00147) remained different after Bonferroni correction. This was intensified when the 56 MEN1(-) were compared with 35 (p<0.05) distinct characteristics being 26 reinforced by Bonferroni correction (p < 0.00142). All the patients with primary hyperparathyroidism (HPT) associations 45 years (a)/PIT (pituitary adenoma) 30yr/dp-NET (duodeno-pancreatic neuroendocrine tumor) 30yr (13), HPT/PIT/dp-NET/positive familial history (15), multiglandular HPT 45yr/PIT 30yr (9), prolactinoma 30yr/positive familial history (10), with MEN1 cases diagnosed <21yr or documented with pd-NET multifocal or two types of pd-NET or with thymic, lung or gastric NET had germline MEN1 mutation. Additionally, cases harboring mutations are associated with significantly higher probability of multiglandular HPT (127-fold), 3 MEN1 related tumor (56-fold), pd-NETs (41.6-fold), malignant neoplasia (19-fold), adrenocortical tumors (7.5-fold), positive familial history (6-fold), male gender (19-fold), prolactinoma (2.8-fold) and pituitary microadenoma (2.5-fold). In contrast, all index-cases diagnosed with single-gland HPT >45y were MEN1(-) (15). MEN1(-) cases were associated with higher probability of HPT>45yr/PIT >30yr (30-fold), acromegaly (18-fold), HPT/PIT (18-fold), HPT>45yr (16-fold), MEN1>45yr (13-fold), e PIT>30yr (4-fold). Also, during the follow-up (9.13+-7.38yr), no MEN1(-) case was diagnosed with a third MEN1 related tumor (0/39 vs. 18/47, 38%; p< 0.0001) or evolved with malign tumors. Indeed, pd-NET was the third most frequent tumor (12/19; 63.1%) in mutation- positive MEN1 cases, followed by PIT (6/19, 31.6%) and HPT (1/19; 5.3%). The overall survival rate of the mutation-positive MEN1 cases was shorter, once they were associated with a higher MEN1-related mortality rate (1/56, 1.8% vs. 14/87, 16%; p<). Ratifying it, 9 patients were diagnosed (7) or progressed with malign pd-NET (2), being that a 10th case was diagnosed with thymic NET during the follow up. A multivariate logistic regression analysis allowed the construction of a model of prediction based in 5 clinical characteristics (present/absent familial history; age >45yr; gender; three or two main tumors, adrenal tumor), useful to predict risk of presence/absence of MEN1 mutation from a given phenotype at the initial evaluation of index-cases clinically diagnosed with MEN1. No genotype-phenotype correlation was documented between 87 index-cases with MEN1 harboring pathogenic variants. However, it is possible that cases with large deletions are associated with more severe phenotype. We discriminated and refined the phenotypic differences and clinical evolution between index-cases harboring germline MEN1 mutation and MEN1 MEN1(-). It was possible to recognize and reveal the isolated and integrated risks of several clinical predictors to foreshadow both presence and absence of mutation and build a predictive probability model with potential application in clinical practice. The complete genetic analysis may help to identify candidate index- cases for Exome studies, better discriminate the phenotype differences between cases with or without known mutations and improve both genetic counselling and clinical management of them