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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2020.tde-11022021-131315
Documento
Autor
Nombre completo
Marcela Rassi da Cruz
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2020
Director
Tribunal
Almeida, Madson Queiroz de (Presidente)
Drager, Luciano Ferreira
Kater, Cláudio Elias
Vieira Neto, Leonardo
Título en portugués
Investigação genética por sequenciamento paralelo em larga escala do hiperaldosteronismo primário causado por hiperplasia adrenal cortical unilateral ou bilateral
Palabras clave en portugués
Canais iônicos
Fosfodiesterases
Genética
Hiperaldosteronismo
Hiperplasia adrenal
Hipertensão
Resumen en portugués
Introdução: O hiperaldosteronismo primário (HP) é a forma mais comum de hipertensão arterial (HA) endócrina com prevalência estimada de aproximadamente 4% em hipertensos atendidos em serviços de atenção primária e de 10% em pacientes referenciados para hospitais terciários. As causas mais frequentes de HP são hiperplasia adrenal cortical bilateral (HB) e aldosteronomas. A hiperplasia adrenal cortical unilateral (HU) é uma causa mais rara de HP, assim como as formas familiais. Na última década, foram feitos consideráveis avanços na patogênese do HP. Variantes patogênicas (VP) somáticas nos genes KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 foram descritos em aldosteronomas. Entre as formas familiais de HP, VPs germinativas no KCNJ5, CACNA1D, CACNA1H e CLCN2 foram identificadas em indivíduos com diagnóstico de HP precoce. No entanto, os defeitos genéticos implicados na patogênese do HP causado por HU ou HB em adultos permanecem pouco elucidados. Objetivos: Investigar as bases genéticas do HP causado por HU ou HB. Os objetivos específicos foram: 1) Investigar VPs somáticas nos genes KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 e CTNNB1 em HU ou HB de indivíduos com HP; 2) Sequenciar o exoma (DNA periférico e do tecido adrenal) dos casos de HU ou HB; 3) Validar e realizar o estudo funcional das novas variantes genéticas encontradas no sequenciamento exômico. Métodos: Foram incluídos 11 pacientes com HP causado por hiperplasia adrenal (5 HU e 6 HB). A presença do gene quimérico CYP11B1/CYP11B2 foi descartada em todos os casos. Em seguida, realizamos o sequenciamento paralelo em larga escala (HiSeq 2500, Illumina), pareado sangue e tecido adrenal, de 5 indivíduos com HP por HU e 6 com HP por HB. Todos os tecidos hiperplásicos apresentaram imunohistoquímica (IHQ) positiva para CYP11B2. Em relação aos achados do exoma, foi feita uma busca por variantes germinativas raras (MAF < 0.01% no gnomAD) em genes codificadores de canais iônicos expressos em tecido adrenal normal ou previamente relacionados com hiperplasia adrenal (como as fosfodiesterases, PDEs). Resultados: Dois casos de HB apresentaram VPs somáticas no KCNJ5 previamente descritas (p.Gly151Arg e p.Leu168Arg). Variantes germinativas em heterozigose e patogênicas in silico foram identificadas em genes codificadores de PDEs: 1) A variante p.Ala59Val na PDE1A em uma paciente com HU; 2) A variante p.Ile629Val na PDE2A em uma paciente com HB; 3) As variantes p.Arg217Gln PDE3B e p.Gly392Val na PDE3B em dois pacientes com HB. A atividade da PKA foi maior no tecido adrenal hiperplásico das pacientes com as variantes p.Ile629Val na PDE2A e p.Gly392Val na PDE3B quando comparada à adrenal normal. A expressão da PDE2A por imunohistoquímica foi forte na zona glomerulosa normal e nódulos hiperplásicos de pacientes com HB. Estudos in vitro em células HEK 293T mostraram redução da expressão da PDE2A mutante em comparação às células transfectadas com PDE2A WT. De forma similar, as variantes na PDE3B (p.Arg217Gln e p.Gly392Val) reduziram a expressão proteica da PDE3B in vitro. Além disso, as variantes da PDE2A e PDE3B promoveram um aumento da expressão da SGK1 e/ou SCCN1G/ENaCg a nível de RNAm ou proteico, que são os principais mediadores da sinalização da aldosterona. Dentre os pacientes com HU, uma nova variante germinativa em heterozigose (c.5428-3C > T) no CACNA1H foi identificada em um caso. Adicionalmente, uma variante germinativa rara em heterozigose e patogênica in silico p.Leu2095Ile no CACNA1I, que codifica a s ubunidade alfa 1 I d o c anal C av 3.3, foi identificada em um paciente com HU. Conclusões: Variantes germinativas raras e provavelmente patogênicas foram identificadas nos genes da PDE2A e PDE3B em pacientes com HB, expandido o espectro de etiologias genéticas para o HP. Adicionalmente, uma variante germinativa rara e patogênica in silico no CACNA1I foi identificada em um paciente com HU associada ao HP
Título en inglés
Genetic investigation by next generation sequencing of primary aldosteronism caused by unilateral or bilateral adrenal hyperplasia
Palabras clave en inglés
Adrenal hyperplasia
Genetics, Phosphodiesterases
Hypertension
Ion channels
Primary aldosteronism
Resumen en inglés
Introduction: Primary aldosteronism (PA) is the most common form of endocrine arterial hypertension with an estimated prevalence of approximately 4% in hypertensives treated in primary care services and 10% in patients referenced to tertiary hospitals. The most frequent causes of PA are bilateral adrenal hyperplasia (BH) and aldosteronomas. Unilateral adrenal hyperplasia (UH) is a rare cause of PA, as well as familial PA. In the past few years, considerable advances have been made towards the pathogenesis of primary aldosteronism (PA). Somatic pathogenic variants in KCNJ5, CACNA1D, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1 genes were identified in aldosteronomas. Among familial PA, germlines defects in KCNJ5, CACNA1D, CACNA1H and CLCN2 were identified in PA patients with early onset of PA. Despite the advances made towards the better understanding of PA pathogenesis, the genetic factors involved in PA caused by UH and BH in adults remain poorly elucidated. Aim: To search for new susceptibility genes in patients with PA caused by UH or BH. The specific aims of this study were: 1) To investigate somatic variants in KCNJ5, ATP1A1, ATP2B3 and CTNNB1 genes in PA caused by UH or BH; 2) To perform exome sequencing (paired blood and adrenal tissue) of PA patients caused by UH or BH; 3) Validate and perform functional studies of genetic variants in new candidate genes. Methods: We included 11 patients with PA caused by adrenal hyperplasia (5 UH and 6 BH). The presence of chimeric CYP11B1/CYP11B2 gene was ruled out in all cases. Then, we performed whole exome sequencing (HiSeq 2500, Illumina) in paired blood and adrenal tissue from five patients with UH and six with BH. All hyperplastic tissues were positive for CYP11B2 staining. We searched for rare germline coding variants (MAF < 0.01% in gnomAD) in ion-channel genes expressed in normal adrenal or in those previously associated with adrenal hyperplasia (such as phosphodiesterases, PDEs). Results: Somatic pathogenic variants in KCNJ5 previously described (p.Gly151Arg e p.Leu168Arg) were identified in 2 BHs. Interestingly, we also identified 4 germline heterozygous variants predicted to be pathogenic in silico in PDEs genes: 1) The p.Ala59Val in PDE1A in a patient with UH; 2) The p.Ile629Val in PDE2A in a patient with BH; and 3) The p.Arg217Gln and p.Gly392Val variants in PDE3B in two patients with BH. Next, PKA activity was analyzed in frozen tissue. PKA activity was increased in adrenal hyperplastic tissue from patients with germline variants p.Ile629Val PDE2A and p.Gly392Val PDE3B compared to normal adrenal. PDE2A staining was strong in zona glomerulosa and in nodules of hyperplastic areas. In vitro studies showed that PDE2A expression was decreased in HEK 293T cells transfected with p.I629V PDE2A vector compared to those transfected with WT PDE2A vector. Similarly, PDE3B expression was decreased in cells transfected with p.Arg217Gln or p.Gly392Val PDE3B vector. Additionally, PDE2A and PDE3B variants increased gene and/or protein expression of SGK1 and SCNN1G/ENaCg, downstream mediators of aldosterone signaling. Regarding patients with UH, we identified a novel germline heterozygous variant (c.5428-3C > T) in CACNA1H gene in one patient with UH. In addition, a rare missense heterozygous variant predicted to be pathogenic in silico (p.Leu2095Ile) in CACNA1I gene, which encodes the alpha 1I subunit of Cav 3.3 channel, was identified in a patient with UH. Conclusions: This evidence suggest that PDE2A and PDE3B variants might be involved with the pathogenesis of BH and expand the spectrum of genetic etiologies for PA. In addition, a rare germline and pathogenic in silico variant in CACNA1I was identified in a patient with PA caused by UH
 
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Fecha de Publicación
2021-02-12
 
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