O desenvolvimento gonadal em mamíferos é um processo dinâmico e complexo, que requer a interação de múltiplos fatores em um meticuloso sistema de retrocontrole e autorregulação. Defeitos nos genes envolvidos nestes processos são uma das causas dos distúrbios/diferenças do desenvolvimento do sexo (DDS). A diferenciação ovariana é o resultado normalmente esperado para o desenvolvimento gonadal em fetos 46,XX. Entretanto, em raros casos, as gônadas de indivíduos 46,XX podem se diferenciar completamente em testículos, condição conhecida como DDS 46,XX testicular (DDS 46,XX T) ou, ainda, ocorrer a coexistência de tecidos testicular e ovariano em um mesmo indivíduo, dando origem ao DDS 46,XX ovotesticular (DDS 46,XX OT). O gene SRY, um importante fator determinante testicular, é identificado em uma fração de pacientes com DDS 46,XX testicular e ovotesticular (DDS 46, XX T/OT), sendo o responsável pelo desenvolvimento gonadal masculino nestes pacientes. Porém, o estudo de várias coortes de pacientes DDS 46, XX T/OT demonstrou que o SRY não é o único gene associado a esses fenótipos. A etiologia heterogênea dessas condições dificulta a análise molecular pelas estratégias tradicionais de estudo de genes candidatos. As novas estratégias de sequenciamento paralelo em larga escala, com avaliação global do material exômico/genômico do indivíduo, veio facilitar a análise simultânea de vários genes já reconhecidos, como também permitir a identificação de novos genes possivelmente envolvidos na etiologia dos DDS. Baseado neste contexto, o presente estudo teve como objetivo principal estabelecer o diagnóstico molecular em um grupo de portadores de DDS 46,XX T/OT sem diagnóstico molecular definido, utilizando a técnica de sequenciamento completo do exoma. O sequenciamento foi realizado na plataforma Illumina. Os dados brutos foram analisados utilizando um pipeline para a identificação de variantes de ponto, indels e variações do número de cópias. As variantes foram classificadas de acordo com os critérios do American College of Medical Genetics. Vinte e quatro pacientes com DDS 46,XX T/OT SRY-negativo foram avaliados, 22 com diagnóstico histológico de DDS OT e dois com diagnóstico não histológico de DDS T. A casuística incluiu 22 pacientes com doença esporádica e uma família com dois irmãos afetados. Em 29,1% (7/24) dos pacientes investigados foi possível identificar um gene candidato associado ao fenótipo. Nenhum gene candidato foi identificado nos dois pacientes com diagnóstico provável de DDS 46,XX T. Das variantes selecionadas como possíveis candidatas à etiologia da doença, duas variantes foram classificadas provavelmente patogênicas (genes FLNB e SOX10) e quatro variantes como de significado incerto, destacando-se as variantes nos genes IMMP2L, SOX8, PRKACG e CLASP1. A variante alélica c.397delT (p.Ser133Leufs7* no IMMP2L foi identificada em heterozigose nos dois irmãos com DDS 46,XX OT e estava ausente nos familiares não afetados (mãe e irmão). As descrições prévias da associação entre o gene Immp2l e a função reprodutiva em mamíferos bem como seu potencial papel na etiologia de linhagens de ovelhas portadoras de XX female-to-male sex reversal, reforçam nossos achados e a possível contribuição desse gene no fenótipo em questão. As variantes alélicas: c.C1329A (p.Ser443Arg) do gene SOX10 e c.C2822A (p.Pro941Gln) do gene FLNB, classificadas como potencialmente patogênicas, também despertaram interesse como potenciais novos genes candidatos. Evidências indicam possíveis interações indiretas dessas proteínas com a regulação do SOX9. O papel de destaque dos genes da família SOX, no processo do desenvolvimento testicular conduziram ao estudo da variante alélica candidata identificada no gene SOX8, categorizada como VUS. Da mesma forma, as variantes alélicas c.A971G (p.Asp324Gly) e c.C3475T (p.Arg1159Cys) identificadas nos genes PRKACG e CLASP1, respectivamente, classificadas como VUS, foram consideradas candidatas. O PRKACG potencialmente interage com genes críticos da cascata da determinação gonadal masculina e já foi anteriormente associado à etiologia de disgenesia gonadal 46,XY. Neste estudo, a segregação das variantes identificadas só pode ser realizada em 25% dos casos, porque os pais não estavam disponíveis para análise nos outros pacientes. A ausência de disponibilidade dos trios limitou a avaliação e a classificação das novas variantes alélicas candidatas. Embora estabelecer a etiologia genética das anormalidades do desenvolvimento gonadal em portadores de 46,XX DDS OT/T permaneça um desafio, os resultados deste estudo geraram informações inéditas, que abrem novas perspectivas de estudo dos mecanismos envolvidos no desenvolvimento gonadal humano, uma complexa e fascinante área da ciência

Gonadal development in mammals is a dynamic and complex process that requires the interaction of multiple factors in a meticulous system of feedback control and self-regulation. Defects in genes involved in these processes are one of the causes of disorders/differences of sex development (DSD). Ovarian differentiation is the ordinarily expected outcome for the gonadal development in 46,XX foetuses. Nevertheless, in rare cases, the gonads of individuals with 46,XX chromosomes can differentiate completely into testes, a condition known as 46,XX testicular DSD (46,XX TDSD). Additionally, can occur the coexistence of testicular and ovarian tissues in the same individual, resulting in 46,XX ovotesticular DSD (46,XX OTDSD). The SRY gene, an important testis-determining factor, is identified in a fraction of patients with 46,XX TDSD and OTDSD (46,XX TDSD/OTDSD), responsible for the male gonadal development in these patients. Conversely, the study of various cohorts of 46,XX TDSD/OTDSD patients has shown that SRY is not the single gene associated with these phenotypes. The heterogeneous aetiology of these conditions hampers molecular analysis using traditional strategies for studying candidate genes. The new strategies of large-scale parallel sequencing, with evaluation of the individual's entire exomic/genomic material, have enabled the simultaneous analysis of multiple recognized genes, as well as the identification of new genes possibly involved in the aetiology of DSD. Based on this context, the present study aimed to establish the molecular diagnosis in a group of patients with 46,XX TDSD/OTDSD without a defined molecular diagnosis, using the technique of whole exome sequencing. Sequencing was performed on the Illumina platform. The raw data were analysed using a pipeline for the identification of point variants, indels, and copy number variations. The variants were classified in compliance with the American College of Medical Genetics criteria. Twenty-four patients with SRY-negative 46,XX TDSD/OTDSD were evaluated, 22 with a histological diagnosis of 46,XX OTDSD and two with a non-histological diagnosis of 46,XX TDSD. The casuistry included 22 patients with sporadic disease and one family with two affected siblings. In 29,1% (7/24) of the investigated patients, it was possible to identify a candidate gene associated with the phenotype. No candidate gene was identified in the two patients with a probable diagnosis of 46,XX TDSD. Among the variants selected as potential candidates for the aetiology of the disease, two variants were classified as likely pathogenic (in the FLNB and SOX10 genes), and four variants were classified as variants of uncertain significance (VUS), with notable variants in the IMMP2L, SOX8, PRKACG and CLASP1 genes. The allele variant c.397delT (p.Ser133Leufs*7) in IMMP2L was identified in heterozygosity in the two siblings with 46,XX OTDSD and was absent in unaffected family members (the mother and a third sibling). Previous descriptions of the association between the Immp2l gene and the reproductive function in mammals, as well as its potential role in the aetiology of XX female-to-male sex reversal in sheep lineages, reinforce our findings and the possible contribution of this gene to the phenotype in question. The likely pathogenic variants c.C1329A (p.Ser443Arg) of the SOX10 gene, and c.C2822A (p.Pro941Gln) of the FLNB gene, sparked interest as potential new candidate genes. Evidence indicates possible indirect interactions of these proteins with the SOX9 regulation. The prominent role of the SOX gene family, in the process of testicular development led to the study of candidate allele variant identified in the SOX8, categorized as VUS. Similarly, the allele variant (c.A971G; p.Asp324Gly) identified in the PRKACG gene and the c.C3475T (p.Arg1159Cys) in the CLASP1, both classified as VUS, were considered candidate variants. The PRKACG potentially interacts with critical genes in the cascade of male gonadal determination and has previously been associated with the aetiology of 46,XY gonadal dysgenesis. In this study, the segregation of the identified variants could only be performed in 25% of the cases because parents were not available for analysis. The lack of availability of trios could have limited the evaluation and classification of new candidate allele variants. Although the establishment of the genetic aetiology of gonadal development abnormalities in individuals with 46,XX TDSD/OTDSD remains a challenge, the results of this study have generated unique information that opens new perspectives for studying the mechanisms involved in human gonadal development, a complex and fascinating area of science