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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2021.tde-28092021-115915
Documento
Autor
Nome completo
Roberta Morozetti Blanco
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Romero, Eliete Caló (Presidente)
Duarte Neto, Amaro Nunes
Lindoso, José Angelo Lauletta
Moreira, Adriana Pardini Vicentini
Título em português
Padronização e avaliação do Teste de Dot-blot IgM para o sorodiagnóstico da leptospirose humana
Palavras-chave em português
Antígenos
Dot Immunoblotting
Fosfatase alcalina
Leptospira
Leptospirose
Peroxidase
Testes sorológicos
Resumo em português
A leptospirose é uma zoonose com ampla distribuição mundial causada por espiroquetas patogênicas do gênero Leptospira spp. Os sintomas da leptospirose podem se apresentar de forma bastante inespecífica dificultando o diagnóstico clínico e por isso o diagnóstico laboratorial é fundamental para a confirmação dos casos. Portanto, o objetivo desse trabalho foi padronizar um teste de Dot-blot IgM para o sorodiagnóstico da leptospirose humana. O teste de Dot-blot IgM foi avaliado utilizando antígenos extraídos de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni e de Leptospira biflexa sorovar Patoc por termoresistência, n-butanol e sonicação para detecção de anticorpos IgM antileptospiras. Além disso, anticorpo anti-IgM humano conjugado com fosfatase alcalina foi comparado a anticorpo anti-IgM humano conjugado com peroxidase. Foram analisadas amostras pareadas de soros de 147 pacientes com leptospirose confirmada pelo teste de aglutinação microscópica (MAT) que apresentaram soroconversão. Foram analisadas também amostras únicas de soro de 88 pacientes com diferentes patologias e 60 amostras de soro de indivíduos sadios, pertencentes ao grupo controle. Os testes de Dot-blot IgM com antígenos extraídos por termo-resistência e com conjugado fosfatase alcalina apresentaram maiores taxas de sensibilidade, principalmente na fase aguda da doença. Assim, foi realizada uma padronização do teste de Dot-blot IgM com conjugado fosfatase alcalina e antígenos extraídos por termoresistência de sorovar Copenhageni (TR2) e de sorovar Patoc (TR19) e foi testado também a mistura desses dois antígenos (TR). Foram analisadas amostras pareadas de 124 casos confirmados de leptospirose pelo MAT que apresentaram soroconversão e como grupo controle, 85 amostras únicas de soro de pacientes com outras doenças e 58 soros de indivíduos sadios foram analisadas. Os resultados foram interpretados por dois observadores independentes. Também foram avaliadas a reprodutibilidade e repetibilidade dos testes. O Dot-blot IgM com antígeno TR19 e conjugado fosfatase alcalina apresentou maior taxa de sensibilidade nos primeiros sete dias após o início dos sintomas (60,5%) e por isso se mostrou melhor que os antígenos TR2 e TR. A sensibilidade desse teste variou de 58,1% a 96,0% entre as primeiras e segundas amostras de soro e a especificidade foi de 93,7%. O teste se mostrou consistente com 100% de repetibilidade e reprodutibilidade e com resultado visual confiável, com concordância quase perfeita entre as interpretações dos resultados realizadas por dois observadores independentes. O teste de Dot-blot IgM com antígeno TR19 e conjugado fosfatase alcalina pode ser utilizado como teste de triagem no diagnóstico sorológico da leptospirose humana
Título em inglês
Standardization and evaluation of the IgM Dot-blot Test for serodiagnosis of human leptospirosis
Palavras-chave em inglês
Alkaline Phosphatase
Antigens
Dot Immunoblotting.
Horseradish Peroxidase
Leptospira
Leptospirosis
Serologic Tests
Resumo em inglês
Leptospirosis is a zoonosis with a worldwide distribution caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira spp. Symptoms of leptospirosis can be nonspecific, making clinical diagnosis difficult, so laboratory diagnosis is essential to confirm cases. Thus, the aim of this work was to standardize an IgM Dot-blot test for the serodiagnosis of human leptospirosis. The IgM Dot-blot test was evaluated using antigens extracted from Leptospira interrogans serovar Copenhageni and Leptospira biflexa serovar Patoc by thermal-resistance, nbutanol and sonication to detect anti-leptospiral IgM antibodies. In addition, antibody anti human IgM conjugated to alkaline phosphatase was compared to antibody anti human IgM conjugated to horseradish peroxidase. Paired serum samples from 147 patients with leptospirosis confirmed by the microscopic agglutination test (MAT) with seroconversion were analyzed. Single serum samples from 88 patients with different pathologies and 60 serum samples from healthy individuals belonging to the control group were also analyzed. The IgM Dot-blot tests with antigens extracted by thermal-resistance and with alkaline phosphatase conjugate showed higher sensitivity rates, especially in the acute phase of the disease. Thus, a standardization of the IgM Dot-blot test with alkaline phosphatase conjugate and antigens extracted by thermal-resistance from serovar Copenhageni (TR2) and from serovar Patoc (TR19) was carried out and the mixture of these two antigens (TR) was also tested. Paired serum samples from 124 confirmed cases of leptospirosis by MAT with seroconversion were analyzed. The control group consisted of 85 single serum samples from patients with other diseases and 58 sera from healthy individuals.The results were interpreted by two independent observers. The reproducibility and repeatability of the tests were also evaluated. IgM Dot-blot with TR19 antigen and alkaline phosphatase conjugate showed a higher sensitivity rate in the first seven days after the onset of illness (60.5%) and therefore proved to be better than TR2 and TR antigens. The sensitivity of the test ranged from 58.1% to 96.0% between the first and second serum samples and the specificity was 93.7%. The test was shown to be consistent with 100% repeatability and reproducibility and with a reliable visual result, with almost perfect agreement between the interpretations of the two independent observers. The IgM Dot-blot test with TR19 antigen and alkaline phosphatase conjugate can be used as a screening test in the serological diagnosis of human leptospirosis.
 
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Data de Publicação
2021-09-28
 
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