O presente estudo caracterizou, mediante análise imunoproteômica, os produtos de excreção/secreção (E/S) de larvas infectantes (iL3) de S. venezuelensis que foram mantidas a 37°C por 24 horas em meio RPMI 1640 (E/S-RPMI) ou em tampão fosfato salino, pH 7,2 (E/S-PBS) e avaliar sua aplicação no imunodiagnóstico da estrongiloidíase humana. Os resultados mostraram que os produtos E/S-RPMI e E/S- PBS possuem 20 e 21 bandas proteicas, com pesos moleculares entre 10 a 348 kDa, e presença de serinoproteases e metaloproteases. O Western-blotting demonstrou que ambos os tipos de produtos de E/S possuem ao menos 16 bandas antigênicas que foram reconhecidas pelo soro de pacientes com estrongiloidíase, das quais apenas uma banda de 36 kDa possui 93% de sensibilidade, 100% de especificidade e sem ocorrência de reatividade cruzada. A espectrometria de massas identificou um total de 71 e 62 proteínas nos produtos E/S-RPMI e E/S-PBS, respectivamente, das quais apenas 14 proteínas antigênicas foram compartilhadas entre ambos os tipos de produtos de E/S. A análise bioinformática sugere que mais de 50% das proteínas identificadas nos produtos de E/S são secretadas ao meio extracelular dentro de vesículas extracelulares ou exossomos e menos de 20% são realmente secretadas pela via clássica. Entre as diferentes proteínas identificadas no presente estudo, pode se ressaltar a presença de uma arginina quinase não glicosilada de 37 kDa, presente em ambos os tipos de produtos de E/S, que coincide com a banda de 36 kDa anteriormente mencionada. Existe uma proteína de domínio CAP que possui 50% de identidade com a proteína recombinante NIE de S. stercoralis, tem o potencial para capturar ácidos graxos e leucotrienos, e possui a sequência KGD com capacidade para se unir específicamente à integrina das plaquetas, inibindo assim a agregação plaquetária. Por outro lado, existe uma enolase de 47 kDa identificada em ambos os produtos de E/S que coincide com uma banda antigênica de 47 kDa reconhecida por mais do 96% dos pacientes com estrongiloidíase. Esta enolase possui o potencial para se unir ao plasminogênio, podendo ser utilizada ativamente pela iL3 de S. ix venezuelensis durante sua migração pelos tecidos do hospedeiro. Destaca-se a também a presença de duas proteínas 14-3-3 identificadas em ambos os tipos de produtos de E/S e com um alto grau de similaridade com seus homólogos presentes no ser humano e no camundongo. A análise bioinformática mostrou que as duas proteínas 14-3-3 são potencialmente antigênicas e são secretadas dentro de vesículas extracelulares. A análise estrutural mostrou que as duas proteínas 14-3-3 possuem a capacidade de união a diferentes proteínas fosforiladas, relacionadas com a ativação de linfócitos T e B, sugerindo um possível papel fundamental na modulação da inflamação e da resposta imune do hospedeiro. Todos estes resultados mostram que S. venezuelensis possui um interessante conjunto de proteínas com potencial antigênico que podem ser explorados como possíveis novos marcadores para o sorodiagnóstico da estrongiloidíase humana

The present study characterized, through immunoproteomic analysis, the excretory/secretory (E/S) products of infective larvae (iL3) of S. venezuelensis obtained by incubating at 37°C for 24 hours in RPMI 1640 medium (E/S-RPMI) or in saline phosphate, pH 7.2 (E/S-PBS) and to evaluate its application in the immunodiagnosis of human strongyloidiasis. The results showed that the E/S-RPMI and E/S-PBS products have 20 and 21 protein bands, respectively, with molecular weights between 10 and 348 kDa, with presence of serine proteases and metalloproteases. Western-blotting demonstrated that both types of E/S products have at least 16 antigenic bands that were recognized by the sera of patients with strongyloidiasis, of which only a 36 kDa band has 93% sensitivity, 100% specificity, and no cross-reactivity. Mass spectrometry identified a total of 71 and 62 proteins in the E/S-RPMI and E/S-PBS products, respectively, of which only 14 antigenic proteins were shared between both types of E-S products. Bioinformatic analysis suggests that more than 50% of the proteins identified in the E/S products are secreted to the extracellular medium within extracellular vesicles or exosomes and less than 20% are actually secreted by the classical pathway. Among the different proteins identified in the present study, the presence of a non-glycosylated arginine kinase of 37 kDa, present in both types of E/S products, which coincides with the previously mentioned 36 kDa band, can be highlighted. There is a CAP domain protein that has 50% identity with the recombinant protein NIE of S. stercoralis, has the potential to capture fatty acids and leukotrienes, and has the sequence KGD with the ability to bind to platelet integrin, inhibiting platelet aggregation. On the other hand, a 47 kDa enolase was identified in both E-S products and coincides with a 47 kDa antigenic band recognized by more than 96% of patients with strongyloidiasis. This enolase has the potential to bind to plasminogen and can be actively used by S. venezuelensis iL3 during its migration through host tissues. It was xi also identified the presence of two 14-3-3 proteins identified in both types of E/S products and with a high degree of similarity with their homologs present in humans and mice. Bioinformatic analysis showed that these two 14-3-3 proteins are potentially antigenic and are secreted into extracellular vesicles. Furthermore, these two 14-3-3 proteins have the ability to bind phosphorylated proteins related to the activation of T and B lymphocytes, suggesting a possible fundamental role in modulating the host inflammation and immune response. All these results show that S. venezuelensis has an interesting set of proteins with antigenic potential that can be explored as possible new markers for the seroodiagnosis of human strongyloidiasis