Introdução: Infecções Relacionadas à Assistência à Saúde (IRAS) são uma das principais causas de mortalidade e morbidade e um importante problema com altos custos para os sistemas de saúde. Antissépticos como a clorexidina (CHG) podem ser uma alternativa na redução dos casos de colonização da pele. Entretanto, mecanismos de resistência, como bombas de efluxo, já foram descritos por estarem relacionados com a resistência dos microrganismos a CHG. Além disso, a presença de biofilme permite que as bactérias sobrevivam em diferentes ambientes. Objetivos: Avaliar a tolerância a clorexidina em microrganismos Gram-negativos e Gram-positivos multirresistentes em células planctônicas e em biofilme; validar a técnica de disco difusão para determinação in vitro de sensibilidade a clorexidina; caracterizar genética e filogeneticamente microrganismos Gram-negativos com concentração inibitória mínima elevada para clorexidina. Materiais e Métodos: Concentração Inibitória Mínima pelo método de diluição em ágar (DA) e microdiluição em caldo (DC) com e sem o inibidor de bomba de efluxo CCCP em 132 isolados; Padronização de método de disco difusão (DD) com clorexidina utilizando 10 isolados com diferentes perfis de sensibilidade a CHG; Análise do Desempenho do Disco de CHG nas concentrações de 5 g e 100g; Produção de biofilme e Concentrações mínima de eliminação de biofilme (CMEBs) com CHG em 38 isolados; Curadoria dos principais mecanismos de resistência a CHG; Análise de concordância entre os métodos utilizando teste de kappa e correlação entre os métodos utilizando o teste de Spearman. Resultados: A resistência a clorexidina pelo método de DA e DC foi de 67,0% (59/88) e 19,3% (17/88) para Enterobactérias (K. pneumoniae e S. marcescens), 18,2% (8/44) e 6,81% (3/44) para não fermentadores (P. aeruginosa e A. baumannii), respectivamete. A resposta ao CCCP nos métodos DA e DC foi de 97,5% (39/40) e 100% (2/2) para K. pneumoniae, 100% (17/17) e 100% (15/15) para S. marcescens e 100% (5/5) e 100% (3/3) em A. baumannii, respectivamente, tiveram diminuição 4 diluições da CIM. Não houve formação de zona de inibição no disco com 5g de clorexidina e no disco de 100g os tamanhos dos halos variaram de 4 - 17mm. No cenário de resistência CIM 32 g/mL, os isolados de K. pneumoniae foram os únicos que apresentaram concordância boa (k = 0,48) entre os métodos DA e DD, para o halo de 16 mm, atendendo os critérios do CLSI. No cenário de resistência CIM 64 g/mL, para S. marcescens obtivemos concordância boa com halos de 12mm (k = 0,58), 13mm (k = 0,65) e 14mm (k = 0,60) nos métodos de DA e DD e 12 mm (k = 0,42) e 13 mm (k = 0,49) nos métodos de DC e DD, mas não atendiam os critérios do CLSI. A produção de biofilme foi testada em 38 isolados Gram-negativos e 06 Gram-positivos. Biofilme forte foi observado em 84,2% dos isolados Gram-negativos e 50,0% em Gram-positivos; moderado em 13,2% e 50,0%, respectivamente. Um isolado Gram-negativo foi não produtor de biofilme. Valores de CMEBs variaram de 128 a 16.384 g/mL em Gram-negativos e de 32 a 16.384 g/mL em Gram-positivos. O fenômeno Eagle effect foi observado em 60,5% (n=23) dos isolados em condição de biofilme, elevando a CIM para 16.384 g/mL e para até 8.192 g/mL em células planctônicas. Em K. pneumoniae, o gene cepA foi observado em 100% dos isolados, seguido dos genes smvAR (90,6%), qacE (85,9%) e qacE (15,6%). Em S. marcescens os genes sdeXY e qacE foram encontrados em 100% das amostras e o gene qacE em 12,5%. Em A. baumannii os genes adeAB foram observados em 100% dos isolados e o gene adeC em 58,6%, os genes aceIR em 93,1% e o gene qacE em 3,44% e nenhum isolado tinha o gene qacE e em P. aeruginosa os genes mexCD-oprJ, qacE e cepA estavam presentes em 100% das amostras, já os genes nfxB e qacE em 93,3% dos isolados. Conclusão: Neste estudo demonstramos um grande percentual de isolados com CIM elevadas para clorexidina, em especial nos isolados de K. pneumoniae e S. marcercens. O CCCP foi capaz de reduzir a CIM para CHG nos isolados de K. pneumoniae, S. marcescens e A. baumannii, exceto para P. aeruginosa. O teste de disco difusão não foi capaz de discriminar isolados sensíveis e resistentes, bem como estabelecer um ponto de corte como fator seletivo de resistência a CHG. O Eagle effect foi um importante achado no nosso estudo levantando um alerta à ocorrência deste fenômeno para evitar falsos resultados de sensibilidade. Não houve diferença entre a presença dos genes de resistência e o perfil de sensibilidade a clorexidina em nenhum dos microrganismos

Introduction: Hospital-acquired infection (HAI) is an important cause of mortality and morbidity and a major problem with high costs for health systems. Antiseptics such as chlorhexidine (CHG) may be an alternative to reduce cases of skin colonization. However, resistance mechanisms, such as efflux pumps, have already been described as related to the resistance of microorganisms to CHG. Furthermore, the presence of biofilm allows bacteria to survive in different environments. Objectives: To evaluate the tolerance to chlorhexidine in Gram-negative and Gram-positive multiresistant microorganisms in planktonic cells and in biofilm; to validate the disk diffusion method for in vitro determination of susceptibility to chlorhexidine; to characterize genetically and phylogenetically Gram-negative microorganisms with high minimum inhibitory concentration to chlorhexidine. Material e Methods: Minimum Inhibitory Concentration by the dilution agar (DA) and broth microdilution (BM) method with and without the efflux pump inhibitor CCCP in 132 isolates; Standardization of disk diffusion (DD) method with chlorhexidine using 10 isolates with different CHG susceptibility profiles ; CHG disc performance analysis at 5 g and 100 g concentrations; Biofilm Production and Minimum Biofilm Elimination Concentrations (MBECs) with CHG in 38 isolates; Curation of the main resistance mechanisms to CHG; Agreement analysis between the methods using the kappa test and correlation between the methods using the Spearman test. Results: Chlorhexidine resistance by the DA and BM method was 67.0% (59/88) and 19.3% (17/88) for Enterobacteriaceae (K. pneumoniae and S. marcescens), 18.2% (8/ 44) and 6.81% (3/44) for non-fermenters (P. aeruginosa and A. baumannii) respectively. Response to CCCP in the DA and DC methods was 97.5% (39/40) and 100% (2/2) for K. pneumoniae, 100% (17/17) and 100% (15/15) for S. marcescens and 100% (5/5) and 100% (3/3) for A. baumannii, respectively, had a MIC decrease of 4 dilutions. There was no formation of zone of inhibition in the disk with 5g of chlorhexidine and in the 100g disk the sizes of the halos varied from 4 - 17mm. In the scenario of MIC resistance 32 g/mL, the K. pneumoniae isolates were the only ones that showed good agreement (k = 0.48) between the DA and DD methods, for the 16 mm halo, meeting the CLSI criteria. In the scenario of MIC resistance 64 g/mL, for S. marcescens we obtained good agreement with halos of 12mm (k = 0.58), 13mm (k = 0.65) and 14mm (k = 0.60) in the methods of DA and DD and 12 mm (k = 0.42) and 13 mm (k = 0.49) in the DC and DD methods but did not meet the CLSI criteria. Biofilm production was tested in 38 Gram-negative and 06 Gram-positive isolates. Strong biofilm was observed in 84.2% of Gram-negative and 50.0% of Gram-positive isolates; moderate at 13.2% and 50.0%, respectively. One Gram-negative isolate was non-biofilm-producing. CMEB values ranged from 128 to 16,384 g/mL in Gram-negatives and from 32 to 16,384 g/mL in Gram-positives. Eagle effect phenomenon was observed in 60.5% (n=23) of the isolates in biofilm condition, increasing the MIC to 16,384 g/mL and up to 8,192 g/mL in planktonic cells. In K. pneumoniae, cepA gene was observed in 100% of the isolates, followed by the smvAR (90.6%), qacE (85.9%) and qacE (15.6%) genes. In S. marcescens the sdeXY and qacE genes were found in 100% of the samples and the qacE gene in 12.5%. In A. baumannii the adeAB genes were observed in 100% of the isolates and the adeC gene in 58.6%, the aceIR genes in 93.1% and the qacE gene in 3.44% and none of isolates had the qacE gene and in P. aeruginosa the mexCD-oprJ, qacE and cepA genes were present in 100% of the samples, while the nfxB and qacE genes were present in 93.3% of the isolates. Conclusion: In this study, we demonstrated a large percentage of isolates with elevated MIC for chlorhexidine, especially in isolates of K. pneumoniae and S. marcescens. CCCP was able to reduce the CHG MIC in K. pneumoniae, S. marcescens and A. baumannii isolates, except for P. aeruginosa. The disk diffusion test was unable to discriminate sensitive and resistant isolates, as well as establish a cutoff point as a selective factor for resistance to CHG. The Eagle effect was an important finding in our study, raising an alert to the occurrence of this phenomenon to avoid false susceptibility results. There was no difference between the presence of resistance genes and the chlorhexidine susceptibility profile in none of the microorganisms tested