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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.5.2021.tde-07012022-140752
Document
Author
Full name
Ingra Morales Claro
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2021
Supervisor
Committee
Sabino, Ester Cerdeira (President)
Faria, Nuno Miguel Rodrigues Pascoal
Romano, Camila Malta
Souza, William Marciel de
Title in Portuguese
Em tempo real, rápida detecção e sequenciamento de arbovírus no Brasil
Keywords in Portuguese
Arbovírus
Diagnóstico
Epidemiologia
Genômica
Metagenômica
Reação em cadeia da polimerase multiplex
RNA
Sequenciamento por nanoporos
Vigilância em saúde pública
Vírus
Abstract in Portuguese
Os vírus emergentes e reemergentes transmitidos por artrópodes (arbovírus) sempre foram uma preocupação global para a saúde humana. O Brasil é um grande país tropical que fornece condições ideais para a existência de muitos arbovírus que são mantidos em uma ampla variedade de ciclos zoonóticos. Nos últimos anos, o Brasil foi afetado por uma onda de graves epidemias, vírus sobrepostos, principalmente causados pelos vírus Zika (ZIKV), dengue (DENV), imunodeficiência humana (HIV), Ebola (EBOV), febre amarela (YFV), e Chikungunya (CHIKV). As epidemias resultantes causaram alta morbidade, mortalidade e custos econômicos. Além disso, há no Brasil a co-circulação de outras arboviroses negligenciadas ou que são pouco discutidas na literatura médica que vêm sendo responsáveis por causar pequenos surtos ou casos esporádicos em diferentes regiões do país. No entanto, a nossa compreensão destes surtos é dificultada pelo desafio do diagnóstico laboratorial (muitas vezes possui baixa especificidade e/ou requer o conhecimento a priori dos vírus a serem analisados) e diagnóstico clínico (geralmente febre, dor de cabeça, dores nas articulações, erupções cutâneas), que por si só, se sobrepõem àquelas causadas pela co-circulação dos vírus transmitidos por artrópodes, resultando em uma disponibilidade limitada de dados de vigilância epidemiológica. Portanto, há uma necessidade urgente de melhorar nossa capacidade de realizar a vigilância de arbovírus a partir de amostras clínicas através de melhores diagnósticos moleculares. Ferramentas de sequenciamento são abordagens que podem, por sua vez, serem usadas para detectar e monitorar a diversidade de arbovírus, identificar linhagens emergentes e controlar o potencial de introdução de novos vírus, sendo capaz de preparar ou até mesmo prevenir novos surtos. Em 2016, o projeto ZiBRA (Zika no Brasil Real Time Analysis) foi pioneiro de uma nova abordagem para a vigilância de arbovírus usando uma tecnologia de sequenciamento portátil baseada em nanopores para obtenção de genomas completos do vírus Zika em tempo real - chamada "epidemiologia genômica". Sendo uma abordagem ainda complexa e limitada pelo número de vírus que podem ser sequenciados simultaneamente (uma reação para cada vírus), o que aumenta muito o custo e não permite a identificação de outros vírus que não estão sendo testados na reação, esta opção ainda é de difícil adoção como protocolo e tecnologia de instrumento de vigilância de rotina em laboratórios de pesquisa e saúde pública. Neste trabalho buscamos gerar novas metodologias que possam ser utilizadas para a vigilância completa de arbovírus, incluindo um painel de detecção e sequenciamento do genoma completo dos principais arbovírus de importância pública e duas abordagens de sequenciamento por metagenômica para rastreio e potencial descoberta de novos vírus. Além disso, buscamos realizar a redução do custo de sequenciamento de arbovírus a US$ 10 por amostra e padronizar uma melhoria no fluxo de trabalho o que acarretará na adoção desta tecnologia por pesquisadores, laboratórios de diagnóstico e laboratórios de vigilância pública resultando em uma maior precisão na vigilância de arboviroses com potencial de introdução e disseminação no Brasil e em outros países e acelerar o ritmo das pesquisas sobre genética e epidemiologia de infecções por arbovírus
Title in English
Real-time, rapid detection and sequencing of arboviruses in Brazil
Keywords in English
Arboviruses
Diagnosis
Epidemiology
Genomics
Metagenomics
Multiplex polymerase chain reaction
Nanopore sequencing
Public health surveillance
RNA
Viruses
Abstract in English
Emerging and re-emerging viruses transmitted by arthropods (arboviruses) have always been a global concern for human health. Brazil is a largely tropical country that provides ideal conditions for the existence of many arboviruses that are maintained in a wide variety of zoonotic cycles. In recent years, Brazil has been affected by a wave of serious epidemics, overlapping viruses, mainly caused by the Zika virus (ZIKV), dengue virus (DENV), human immunodeficiency virus (HIV), Ebola virus (EBOV), yellow fever virus (YFV), and Chikungunya virus (CHIKV). The resulting epidemics caused high morbidity, mortality, and economic costs. In addition, there is in Brazil the co-circulation of other arboviruses that are neglected or that are little discussed in the medical literature, which have been responsible for causing small outbreaks or sporadic cases in different regions of the country. However, our understanding of these outbreaks is hampered by the challenge of laboratory diagnosis (often has low specificity and/or requires a priori knowledge of the viruses to be analyzed) and clinical diagnosis (generally fever, headache, joint pain, rashes), which by themselves overlap with those caused by the co-circulation of arthropod-borne viruses, resulting in limited availability of epidemiological surveillance data. Therefore, there is an urgent need to improve our ability to conduct arbovirus surveillance from clinical specimens through better molecular diagnostics. Sequencing tools are approaches that can, in turn, be used to detect and monitor arbovirus diversity, identify emerging strains and control the potential for the introduction of new viruses, being able to prepare or even prevent new outbreaks. In 2016, the ZiBRA (Zika in Brazil Real-Time Analysis) project pioneered a new approach to arbovirus surveillance using portable nanopore-based sequencing technology to obtain complete genomes of the Zika virus in real time - called "genomic epidemiology ". Being an approach that is still complex and limited by the number of viruses that can be sequenced simultaneously (one reaction for each virus), which greatly increases the cost and does not allow the identification of other viruses that are not being tested in the reaction, this option is still difficult to be adopted as protocol and technology as a routine surveillance tool in research and public health laboratories. In this work, we seek to generate new methodologies that can be used for complete arbovirus surveillance, including a full genome detection and sequencing panel of the main arboviruses of public importance and two metagenomic sequencing approaches for screening and potential discovery of new viruses. In addition, we seek to reduce the cost of arbovirus sequencing to US$ 10 per sample and standardize an improvement in the workflow which will lead to the adoption of this technology by researchers, diagnostic laboratories, and public surveillance laboratories resulting in greater accuracy in the surveillance of arboviruses with the potential for introduction and spread in Brazil and other countries, and accelerate the pace of research on the genetics and epidemiology of arbovirus infections
 
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IngraMoralesClaro.pdf (19.62 Mbytes)
Publishing Date
2022-01-18
 
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