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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.5.2021.tde-05042022-160637
Document
Auteur
Nom complet
Vivian Caso Coelho
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2021
Directeur
Jury
Lopes, Marta Heloisa (Président)
Costa, Silvia Figueiredo
Melhem, Marcia de Souza Carvalho
Silva, Érica Chimara
Titre en portugais
Avaliação da suscetibilidade antimicrobiana de isolados de Nocardia spp. por microdiluição em caldo com o uso de resazurina e espectrofotometria
Mots-clés en portugais
Espectrofotometria
Microdiluição em caldo
Nocardia
Resazurina
Testes de sensibilidade microbiana
Resumé en portugais
O gênero Nocardia sp. compreende um amplo grupo de bactérias que podem ser encontradas no solo, matéria orgânica, água fresca e salgada. A nocardiose, doença causada por microrganismos desse gênero, é especialmente grave em pacientes imunodeprimidos que podem apresentar abscessos cerebrais e septicemia. Os sinais clínicos são muitas vezes similares aos de outras infecções, podendo levar ao tratamento inadequado e à consequente disseminação sistêmica. Dessa forma, a identificação correta das espécies de Nocardia e o estudo da suscetibilidade antimicrobiana é subsídio para o tratamento dos pacientes. Entre os testes de suscetibilidade, destaca-se a microdiluição em caldo que determina a Concentração Inibitória Mínima (CIM) de um antimicrobiano necessária para conter o crescimento de microrganismos. No entanto, há relatos na literatura de subjetividade na visualização e interpretação dos resultados desse teste com Nocardia spp. Assim, como tentativa de reduzir a subjetividade na interpretação, o presente estudo avaliou duas formas alternativas de leitura de resultados dos ensaios de microdiluição em caldo com isolados de Nocardia spp., uma empregando o sal de resazurina e outra com a leitura das densidades ópticas por espectrofotometria, e comparou-as com a leitura Visual Padrão Ouro. Para tanto, inóculos de cepas de bactérias de referência e de quinze isolados clínicos de Nocardia spp. foram incubados com os antimicrobianos Amicacina, Ciprofloxacina, Minociclina e Trimetoprima-Sulfametoxazol (TMP-SMX), diluídos previamente em microplacas de 96 poços. Paralelamente, duas microplacas por antimicrobiano foram inoculadas com as bactérias de forma idêntica, porém, uma recebeu resazurina. Foram então realizadas as leituras das CIMs: Visual sem resazurina (VPO; método Padrão Ouro), Visual com Resazurina (VRE), e leitura das densidades ópticas em espectrofotômetro (ESP). Os percentuais das concordâncias numérica (valor das CIMs) e categórica (classificação em suscetível, resistência intermediária ou resistente) foram calculados intra-leituras (mesmo tipo de leitura, em dias diferentes) e inter-leituras (entre as três diferentes leituras, ensaios paralelos). Na análise geral das médias dos percentuais de concordância das leituras com Amicacina, a VPO demonstrou 100,0% de concordância categórica e, também foi 100,0% concordante com VRE e com ESP. Com Ciprofloxacina, as concordâncias categóricas intra-leituras foram em média 82,9%. Observou-se 88,0 e 91,5% na análise categórica de VPO e ESP, respectivamente, com Minociclina e, quando comparadas entre si, 87,7%. Percentuais acima de 91% também foram observados nas análises categóricas com TMP-SMX, sendo 95,5% na VPO, 99,2% em ESP, e 91,7% quando essas leituras foram comparadas entre si. Os métodos alternativos, uso da resazurina e do espectrofotômetro, demonstraram altos percentuais de concordância com a leitura padrão ouro, sugerindo o uso desses métodos, em laboratórios de rotina, na avaliação da suscetibilidade de isolados de Nocardia spp. a antimicrobianos
Titre en anglais
Evaluation of Nocardia spp. isolates antimicrobial susceptibility by broth microdilution with the use of Resazurin and Spectrophotometry
Mots-clés en anglais
Antimicrobial susceptibility testing
Broth microdilution
Nocardia
Resazurin
Spectrophotometry
Resumé en anglais
The genus Nocardia sp comprises a large group of bacteria that can be found in soil, organic matter, fresh and salt water. Immunosuppressed patients present the most severe nocardiosis manifestations such as cerebral abscesses and septicemia. Clinical signs are often similar to those of other infections, leading to inadequate treatment and consequent systemic spread. Thus, the correct identification of Nocardia species has become increasingly important for treatment, antimicrobial susceptibility studies, clinical and epidemiological investigations. Antimicrobial susceptibility tests, such as broth microdilution method, determine the Minimum Inhibitory Concentration (MIC), which is the minimum antimicrobial concentration required to contain the proliferation of a microorganism. However, subjectivity in the visualization and interpretation of broth microdilution results were addressed by many reports. In the present study, the application of resazurin and OD readings by Spectrophometry were investigated as an attempt to reduce subjectivity in the interpretation of susceptibility to antimicrobials testing on Nocardia spp. by broth microdilution method. Fithteen Nocardia spp. isolates and American Type Culture Collection (ATCC) strains were incubated with the antimicrobials amikacin, ciprofloxacin, minocycline and trimethoprim-sulfamethoxazole (TMP-SMX), previously diluted in a 96-well microplates. Two microplates per antimicrobial were inoculated identically, however, one received resazurin. MIC readings were then performed by three reading methods: the Gold Standard reading (CLSI recommended method with visually determined MIC), the Resazurin reading (visually determined MIC with Resazurin), and the OD reading (ODs determined MIC by spectrophotometry). The percentages of agreement were calculated on intrareading (same reading method, independent assays) and on inter-reading comparisons of methods (different reading methods, same assay). The Gold Standard visual reading demonstrated 100.0% of essential and categorical intrareading agreements for Amikacin and it was 100.0% in agreement with the Resazurin and the Spectrophotometric readings. For Ciprofloxacin, intra-reading categorical agreements averaged 82.9%. There were 88.0 and 91.5% in the categorical analysis of the Gold Standard and of the Spectrophotometric readings, respectively, with Minocycline. When compared to each other, 87.7%. Percentages over 91.0% were also observed on the cathegorical analyses for TMP-SMX, with 95.5% on the Gold Standard visual reading, 99.2% on the Spectrophotometric reading, and 91.7% between them. In conclusion, the alternative methods with Resazurin and Spectrophotometric readings showed high agreement rates with the Gold Standard, suggesting a promising use of those methods on the evaluation of Nocardia spp. isolates susceptibility to antimicrobial agents
 
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Date de Publication
2022-04-07
 
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