Os linfomas cutâneos primários de células T (LCCT) são um grupo heterogêneo de linfomas não Hodgkin que se manifestam inicialmente na pele. Micose fungoide (MF) é o LCCT mais prevalente, e a síndrome de Sézary (SS) é uma variante leucêmica agressiva. A forma avançada de LCCT está correlacionada com prurido intenso, sistema imunológico disfuncional e inflamações cutâneas crônicas. De fato, infecções bacterianas são recorrentes e, pacientes em estágio avançado, muitas vezes vão a óbito em decorrência de sepse e não do tumor em si. Comprometimento da barreira cutânea e aumento na expressão de fatores angiogênicos são comuns no LCCT, entretanto, as origens dessas alterações ainda são pouco estudadas. Células tumorais influenciam e modulam o funcionamento de outras células por diferentes vias, uma delas é via secreção de nanovesículas no espaço extracelular (sEV). sEV são estruturas esféricas com bicamada lipídica que transportam em seu interior uma grande diversidade de componentes bioativos como citocinas, quimiocinas, ligantes de receptores de ativação/inibição, diferentes tipos de ácidos nucleicos, enzimas, entre outros. As sEV podem ser captadas e internalizadas por outras células, sendo consideradas mediadores da comunicação intercelular e amplamente estudadas em neoplasias. Entretanto, evidencias da contribuição de sEV para a patogênese no LCCT são escassas. Portanto, o estudo teve por objetivo obter e caracterizar o conteúdo proteico de sEV tumorais no LCCT e avaliar o efeito da captação e internalização de sEV-LCCT por queratinócitos imortalizados. sEV derivadas das linhagens tumorais de LCCT, Myla2059 (MF) e Hut78 (SS), foram obtidas de meio condicionado por protocolo baseado em centrifugação diferencial, ultrafiltração e cromatografia por exclusão de tamanho. Os parâmetros de perfil morfológico, de diâmetro (167nm e 159nm) e de expressão proteica (Hsp-70, CD81 e RAB5), avaliados respectivamente por criomicroscopia eletrônica de transmissão (Crio-TEM), análise do rastreamento de partículas (NTA) e western blotting (WB), se mostraram típicos de sEV. Identificamos, por espectrofotometria de massa (MS), 620 proteínas carreadas pelas sEV-LCCT, dentre integrinas e moléculas de adesão celular (CD62L, ALCAM/CD166, ITGB1, TGB2) marcadores relacionados a tumorigênese (CD70, LGALS1, LGALS3BP, KIT e PDGFRB) e marcadores comuns em células T (CD26, CD40LG, IL1R2, IL1RAP e IL27b). Por meio de avaliações por citometria de fluxo e de imagem, observamos que queratinócitos absorvem e captam sEV-LCCT de maneira dependente de temperatura. Após a confirmação da incorporação de sEV-LCCT para o citosol dos queratinócitos pela análise de z- stack por microscopia confocal, o perfil de expressão gênica de queratinócitos tratados com sEV- LCCT foi analisado por sequenciamento de RNA e RT-qPCR. Observamos regulação negativa de moléculas relacionadas a manutenção da barreira cutânea como filagrina, loricrina, involucrina, desmogleínas, desmocolinas e caderinas. Diversos genes relacionados com a formação da camada córnea também foram alterados (STAB1, LCE1E, HRNR e S100A8). A expressão de fatores relacionados ao processo de angiogênese (ESM1, VEGF-A-C-D, PGF) e pruritogênicos (NFG) foi maior após o tratamento com sEV-LCCT. Por fim, dentre os genes diferencialmente expressos com maior regulação positiva, observamos fatores pró-inflamatórios (CSF2, CXCL8, SERPINB2, GRZB, CXCL3 e SPRRs). Assim, concluímos que o tratamento de sEV-LCCT alterou a expressão de transcritos relacionados a via de inflamação, adesão celular e formação do envelope cornificado em queratinócitos imortalizados. Os dados são inéditos e sugerem a contribuição de sEV derivadas de células tumorais no processo de inflamação crônica, angiogênese e comprometimento da barreira cutânea no LCCT

Primary cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are a heterogeneous group of non-Hodgkin lymphomas that initially manifest in the skin. Mycosis fungoides (MF) is the most prevalent CTCL, and Sézary syndrome (SS) is an aggressive leukemic variant. The advanced form of CTCL is correlated with severe pruritus, a dysfunctional immune system, and chronic skin inflammation. In fact, bacterial infections in immunocompromised patients with advanced-stage CTCL often leads to sepsis and death. Dysfunctional skin barrier and increased expression of angiogenic factors are common in CTCL, however, the origins of these changes are still not completely understood. Tumor cells influence and modulate other cells behavior in different ways, one of which is via the secretion of nanovesicles into the extracellular space (sEV). sEV are spherical structures with a lipid bilayer that carry within them a great diversity of bioactive components such as cytokines, chemokines, ligands of activation/inhibition receptors, different types of nucleic acids, enzymes, among others. sEV can be captured and internalized by other cells, being considered mediators of intercellular communication and widely studied in neoplasms. However, evidence of the contribution of sEV to the pathogenesis of CTCL is scarce. Therefore, the study aimed to obtain and characterize the protein content of tumural sEV in CTCL and to evaluate the sEV-CTCL uptake and internalization effects by immortalized keratinocytes. sEV derived from the CTCL cell lines, Myla2059 (MF) and Hut78 (SS), were obtained from conditioned medium by a protocol based on differential centrifugation, ultrafiltration and size exclusion chromatography. The morphological profile, diameter (167nm and 159nm) and protein expression markers (Hsp-70, CD81 and RAB5), evaluated respectively by transmission electron cryo-microscopy (Cryo-TEM), particle tracking analysis (NTA) and western blotting (WB), were typical of sEV. We identified by mass spectrophotometry (MS) 620 proteins carried by sEV-CTCL, among integrins and cell adhesion molecules (CD62L, ALCAM/CD166, ITGB1, TGB2) tumorigenesis-related markers (CD70, LGALS1, LGALS3BP, KIT and PDGFRB) and common markers on T cells (CD26, CD40LG, IL1R2, IL1RAP and IL27b). Flow cytometry and imaging flow cytometry confirmed keratinocytes sEV-CTCL absorption in a temperature-dependent manner. The incorporation of sEV-CTCL into the keratinocytes cytosol was visualized by z-stack analysis with confocal microscopy. Then, the gene expression profile of sEV-CTCL-treated keratinocytes was analyzed by RNA sequencing and RT- qPCR. We observed downregulation of molecules related to skin barrier maintenance such as filaggrin, loricrin, involucrin, desmogleins, desmocholines and cadherins. Stratum corneum formation related genes expression was also aberrant (STAB1, LCE1E, HRNR and S100A8). The pro-angiogenic factors expression (ESM1, VEGF-A/C/D and PGF) and pruritogens (NFG) was upregulated after sEV-CTCL treatment. In addition, pro-inflammatory factors (CSF2, CXCL8, SERPINB2, GRZB, CXCL3 and SPRRs) were among the upregulated differentially expressed genes. We conclude that sEV-CTCL treatment leads to aberrant expression of genes related to the inflammation pathway, cell adhesion and cornified envelope formation in immortalized keratinocytes. Our study is the first to suggest the contribution of tumor -derived sEV in the chronic inflammation, angiogenesis and impairment of the skin barrier in CTCL