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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.5.2013.tde-26092013-155601
Documento
Autor
Nome completo
Antonio Jose Gonçalves e Leal
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Tannuri, Ana Cristina Aoun (Presidente)
Odone Filho, Vicente
Bacchella, Telesforo
Miguel, Gustavo Peixoto Soares
Sbragia Neto, Lourenço
Título em português
Modelo de transplante hepático large-for-size em suínos: estudos bioquímicos, histológicos, moleculares e efeito do pré-condicionamento isquêmico
Palavras-chave em português
Apoptose
Isquemia
Modelos animais
Precondicionamento isquêmico
Regeneração hepática
Reperfusão
Suínos/cirurgia
Transplante de fígado
Transplante de fígado/métodos
Resumo em português
INTRODUÇÃO: O transplante hepático se consolidou como terapêutica para crianças com doença hepática em estágio terminal. A principal indicação nessa faixa etária é a atresia das vias biliares, doença colestática que leva à cirrose hepática na maioria dos casos nos primeiros anos de vida mesmo nas crianças submetidas a portoenterostomia. Essas crianças evoluem entre outras complicações com desnutrição grave e necessitam do transplante precocemente. A relação ideal do peso do enxerto hepático e o peso do receptor varia de 1 a 3%. No entanto, quando o transplante é realizado em crianças em idade inferior a 2 anos, essa relação na maioria das vezes é maior do que 5%. Essa situação é conhecida como large-for-size, em que a perfusão sanguínea do enxerto pode ser insuficiente, o que leva a disfunção do órgão. Os mecanismos de lesão neste cenário ainda não estão bem esclarecidos. A lesão de isquemia-reperfusão (IR) é apontada como um dos fatores para o mal funcionamento do enxerto bem como de outras complicações. Nessa lesão estão envolvidos elementos da cascata inflamatória culminando em morte celular por apoptose bem como mecanismos de regeneração celular. Um fenômeno conhecido que atenua a lesão de IR é o pré-condicionamento isquêmico (PCI). Nenhum trabalho experimental foi realizado com o objetivo de avaliar a lesão hepática na situação large-for-size e o efeito do PCI nessa situação. MÉTODOS: Para a padronização do modelo foram realizados 8 transplantes, tendo sido testados os pesos dos animais, relação entre o peso do enxerto hepático e peso do receptor e técnica cirúrgica. Na fase experimental, foram realizados 21 transplantes e os animais foram divididos em 3 grupos. No primeiro grupo (controle) o transplante era realizado com doadores e receptores com pesos similares. Para caracterização da situação large-for-size, no segundo grupo os doadores tinham aproximadamente o dobro do peso dos receptores (LFS). No terceiro grupo a distribuição de peso foi semelhante a do segundo, porém era realizado o PCI no doador (LFS+PCI). Os procedimentos foram realizados sob anestesia geral e técnica asséptica e os animais foram mantidos vivos por 3 horas após a reperfusão. Foram obtidas amostras de sangue em 3 períodos (logo após abertura da cavidade abdominal, 1 e 3 horas após reperfusão) e fragmentos de fígado 1 e 3 horas após reperfusão. As amostras de sangue foram submetidas a gasometria arterial, dosagem de sódio, potássio e enzimas hepatocelulares. Os fragmentos de tecido hepático foram submetidos a análise histológica pela coloração da hematoxilina-eosina (HE) e a análise de quantificação da expressão dos genes pró-apoptótico (Bax), anti-apoptótico (Bcl- XL), da óxido nítrico-sintase endotelial (eNOS) e da interleucina-6 (IL-6). RESULTADOS: A mortalidade observada foi de 28%. A relação peso do enxerto e peso do paciente foi de 2,9% no grupo controle, 6,3% no grupo LFS e 6,4% no grupo LFS+PCI. A natremia 1 hora após a reperfusão foi mais elevada no grupo controle do que nos demais, já com relação ao potássio, a dosagem foi mais baixa nesse grupo no mesmo intervalo. A dosagem da aspartato aminotransferase (AST) foi mais elevada nos grupos LFS e LFS+PCI do que no controle. A análise histológica não Resumo demonstrou diferença entre os grupos. A expressão do gene Bax foi mais elevada no grupo LFS do que nos demais, enquanto que a do gene eNOS foi mais acentuada no grupo LFS+PCI do que nos demais nos dois intervalos estudados. Após 3 horas de reperfusão a expressão do gene IL-6 foi maior no grupo LFS+PCI. CONCLUSÕES: O modelo de transplante hepático large-for-size em suínos foi exequível e adequado para a pesquisa. A lesão IR foi mais acentuada no grupo LFS do que no grupo controle e apesar de não ter alterado a elevação de enzimas hepatocelulares, o PCI teve papel de aumentar a expressão dos genes IL-6 e eNOS e diminuir a do gene Bax
Título em inglês
Model of large-for-size porcine liver transplantation: biochemical, histological and molecular studies, and evaluation of the effects of ischemic preconditioning
Palavras-chave em inglês
Apoptosis
Ischemia
Ischemic preconditioning
Liver regeneration
Liver transplantation
Liver transplantation/methods
Models animal
Reperfusion
Swine/surgery
Resumo em inglês
INTRODUCTION: Liver transplantation has been established as therapy for children with end-stage liver disease. The main indication is biliary atresia, cholestatic disease that leads to cirrhosis in most cases even in children undergoing portoenterostomy. These children develop other complications as severely malnutrition and need early transplantation. The ideal graft to body weight ratio (GBWR) for transplantation varies from 1 to 3%. However, when transplantation is performed in children younger than 2 years, this ratio in most cases is higher than 5%. This situation, known as large-for-size, may be related to insufficient graft perfusion and liver disfunction. The mechanisms of injury involved in this scenario are not well established. Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been related as a factor for poor graft function and other complications. Inflammatory cascade culminating in cell death by apoptosis and cellular mechanisms of regeneration are the elements involved in IRI. Ischemic preconditioning (IPC) is a phenomenon that attenuates IR injury. There are no experimental studies conducted to evaluate the hepatic injury in large-for-size situation and the effect of IPC in this situation. METHODS: 8 procedures were required for standardize the model. Weight of the animals, GBWR and surgical technique were evaluated. In the experimental phase, 21 transplantations were performed. The animals were divided in three groups. In the first group (control), liver transplantation was performed with donors and recipients with similar weights. To characterize large-for-size situation, donors of the second group had approximately twice the weight receptor (LFS). In the third group the weight distribution was similar to the second but IPC was performed in donor (LFS+IPC). Procedures were performed under general anesthesia and aseptic technique and the animals were kept alive for 3 hours after reperfusion. Blood samples were obtained at three times (immediately after opening the abdominal cavity, 1 and 3 hours after reperfusion) and fragments of liver 1 and 3 hours after reperfusion. Blood samples were analyzed for arterial blood gases, sodium, potassium and hepatocellular enzymes. The fragments of liver tissues were subjected to histological analysis by hematoxylin-eosin staining (HE). Molecular biology involved quantification of the expression of Bax, Bcl-XL, endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and interleukin- 6 (IL-6) genes. RESULTS: The mortality rate was 28%. The GBWR was 2.9% in the control group, 6.3% in the LFS group and 6.4% in the LFS+ICP group. The natremia 1 hour after reperfusion was higher in the control group and potassium dosage was lower in this group in the same period. The dosage of aspartate aminotransferase (AST) was higher in LFS and LFS+IPC groups than control. Histological analysis showed no difference between groups. The Bax gene expression was higher in the LFS, while the eNOS gene was more expressed in LFS + PCI group. After 3 hours of reperfusion the expression of IL-6 gene was higher in the PCI + LFS. CONCLUSIONS: The model of large-for-size liver transplantation in swine was feasible and appropriate for the research. IR injury was more pronounced in the Summary group LFS than in the control group and despite not having changed the elevation of hepatocellular enzymes, the PCI was responsible for increasing the expression of IL- 6 and eNOS and decreasing the Bax gene expression
 
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Data de Publicação
2013-09-26
 
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