Células musculares lisas estão em equilíbrio mecânico com o microambiente vascular. As adesões focais são os pontos de ajuste em resposta às deformações ativas e passivas da matriz extracelular. Este fenômeno depende de proteínas de adesões focais que percebem, transmitem e respondem a estímulos físicos. Nosso laboratório demonstrou que a proteína CRP3 atua como mecanossensor em células musculares lisas aórticas, regulando a ativação da quinase de adesão focal (FAK) em resposta ao estiramento. Evidências preliminares sugerem que a ausência da CRP3 previne o remodelamento de adesões focais, prejudicando a contratilidade das células musculares lisas. Este fenótipo se assemelha ao observado em células com prejuízo na sinalização de FAK-Src, enquanto as evidências da literatura apontam também para um papel regulador do CRP3 sobre o citoesqueleto de actina. Logo, postulamos que a CRP3 é crítica para a mecanotransdução de células musculares lisas atuando como ponte molecular entre as adesões focais e o citoesqueleto de actina. Ao estimular células musculares lisas aórticas com angiotensina II (Ang II), verificamos que a ausência de CRP3 prejudica a ativação do eixo FAK-paxilina- p130CAS, via de sinalização fundamental à mecanotransdução. A fim de caracterizar as consequências desta deficiência, analisamos a dinâmica do citoesqueleto de actina, a fosforilação da cadeia regulatória da miosina (MLC) e a quimiotaxia dependente de PDGF-BB. A razão F/G-actina, a fosforilação inibitória de cofilina e os níveis de YAP foram comparáveis em células selvagens (WT) versus CRP3-/- em condições basais e em resposta à angiotensina II. Em concordância, os marcadores de músculo liso dependentes de actina (-SMA, calponina, MYH11 e smoothelina) assim como os níveis de fosforilação de MLC e a contração em resposta ao KCl não se modificaram entre os genótipos, sugerindo que a ausência de CRP3 não afeta o citoesqueleto de actina. A quimiotaxia dependente de PDGF-BB foi menor em células CRP3-/-, consistente com uma deficiência na sinalização de FAK. Esta deficiência se mostrou desacoplada de alterações na viabilidade celular, já que células selvagens e CRP3-/- apresentam progressão similar do ciclo celular. A fim de confirmar a dependência dos eventos de sinalização dependentes de FAK, realizamos ensaios de contração em gel de colágeno e de rigidez por citometria magnético- óptica de oscilação (OMTC) na presença de inibidor de FAK (iFAK). Enquanto a contração de células WT foi negativamente impactada por iFAK, não observamos nenhum efeito nas células CRP3-/-. Já o ensaio de OMTC demonstrou que a rigidez celular é independente da ativação de FAK. A análise da estrutura de CRP3 evidenciou a presença de dois resíduos de tirosina passíveis de fosforilação por FAK (Y57 e Y167), responsivos à Ang II em células cardíacas, podendo então explicar a dependência de CRP3 para a ativação de FAK e promoção da contração. Os dados apresentados revelam que a CRP3 é necessária à ativação do eixo FAK-paxilina-p130CAS, sinalização necessária e suficiente à migração e contratilidade. Na ausência de CRP3, há comprometimento das cascatas de sinalização à jusante, comprometendo a percepção do ambiente e a mecanossinalização, componentes-chave da mecanotransdução vascular. Em conjunto, apresentamos evidências de que a CRP3 influencia a mecanotransdução em células musculares lisas aórticas atuando como ponte entre a actina e as adesões focais

Smooth muscle cells are in mechanical equilibrium with the vascular microenvironment. Focal adhesions are the set points in response to active and passive deformations of the extracellular matrix. This phenomenon depends on focal adhesion proteins that perceive, transmit and respond to physical stimuli. Our laboratory demonstrated that the CRP3 protein acts as a mechanosensor in aortic smooth muscle cells, regulating the activation of the focal adhesion kinase (FAK) in response to stretch. Preliminary evidence suggests that the absence of CRP3 prevents remodeling of focal adhesions, impairing the contractility of smooth muscle cells. This phenotype is similar to that observed in cells with impaired FAK-Src signaling, while evidence from the literature also points to a regulatory role of CRP3 on the actin cytoskeleton. Therefore, we postulate that CRP3 is critical for smooth muscle cell mechanotransduction acting as a molecular bridge between focal adhesions and the actin cytoskeleton. By stimulating aortic smooth muscle cells with angiotensin II (Ang II), we found that the absence of CRP3 impairs the activation of the FAK-paxillin-p130CAS axis, a fundamental signaling pathway for mechanotransduction. In order to characterize the consequences of this deficiency, we analyzed the dynamics of the actin cytoskeleton, the phosphorylation of the myosin regulatory chain (MLC) and the PDGF-BB-dependent chemotaxis. F/G-actin ratio, inhibitory cofilin phosphorylation, and YAP levels were comparable in wild-type (WT) versus CRP3-/- cells under basal conditions and in response to angiotensin II. In agreement, actin-dependent smooth muscle markers (-SMA, calponin, MYH11 and smoothelin) as well as levels of MLC phosphorylation and contraction in response to KCl did not change between genotypes, suggesting that the absence of CRP3 does not affect the actin cytoskeleton. PDGF-BB-dependent chemotaxis was lower in CRP3-/- cells, consistent with a deficiency in FAK signaling. This deficiency was shown to be uncoupled from changes in cell viability, as wild-type and CRP3-/- cells show similar cell cycle progression. To confirm the dependence of FAK-dependent signaling events, we performed collagen gel contraction and optical-magnetic twisting cytometry (OMTC) stiffness assays in the presence of FAK inhibitor (iFAK). While the contraction of WT cells was negatively impacted by iFAK, we did not observe any effect on CRP3-/- cells. The OMTC assay demonstrated that cell rigidity is independent of FAK activation. Analysis of the structure of CRP3 evidenced the presence of two tyrosine residues capable of phosphorylation by FAK (Y57 and Y167), responsive to Ang II in cardiac cells, which may explain the dependence of CRP3 for FAK activation and contraction promotion. The data presented reveal that CRP3 is necessary for the activation of the FAK-paxillin-p130CAS axis, a necessary and sufficient signaling for migration and contractility. In the absence of CRP3, downstream signaling cascades are compromised, impairing environmental perception and mechanosignaling, key components of vascular mechanotransduction. Together, we present evidence that CRP3 influences mechanotransduction in aortic smooth muscle cells by acting as a bridge between actin and focal adhesions