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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.47.2020.tde-08022021-152740
Documento
Autor
Nome completo
Vitor Henrique Corredor
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2020
Orientador
Banca examinadora
Ventura, Dora Selma Fix (Presidente)
Gonçalves, Arlan da Silva
Rocha, Fernando Allan de Farias
Título em português
Análise genética dos pigmentos visuais da Tartaruga-de-Orelha-Vermelha,Trachemys scriptaelegans (Testudine, Emydidae)
Palavras-chave em português
11-cis-3
11-cis-retinal
4-dehidroretinal
Fotorreceptores
Opsinas
Retina
Trachemys scripta elegans
Resumo em português
O sistema visual dos vertebrados é responsável pela captura e processamento das informações luminosas do ambiente, processo que se inicia na retina a partir da absorção de um quantum de luz pelos pigmentos visuais, localizados no segmento externo dos fotorreceptores, cones e bastonetes. Os pigmentos visuais são proteínas de membrana da família dos receptores acoplados à proteína G, opsinas e rodopsinas, ligados a uma molécula fotossensível derivada da vitamina A1, retinal, e em algumas espécies, o 3,4-dehidroretinal, derivado da vitamina A2. A interação do cromóforo com resíduos de aminoácidos específicos determina a banda de absorção espectral e respectivo comprimento de onda máximo (max) do pigmento visual. Adicionalmente, a troca do cromóforo retinal pelo 3,4-dehidroretinal, ocasiona o deslocamento batocrômico do max. A tartaruga-de-orelha-vermelha, Trachemys scripta elegans, utiliza o 3,4-dehidroretinal e expressa as cinco classes de opsinas de vertebrados, a rodopsina, RH1, em bastonetes, com max em 518 nm, e quatro opsinas expressas em diferentes cones, SWS1 (max 372 nm), SWS2 (max 458 nm), RH2 (max 518 nm) e LWS (max 617 nm). Este estudo teve como objetivo sequenciar os cinco genes de opsinas visuais expressos na retina de T. s. elegans e predizer o max das opsinas com base na sequência de aminoácidos e em modelos computacionais. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa com Animais do Instituto de Psicologia da Universidade de São Paulo (Protocolo 5446131117). Um indivíduo adulto foi eutanasiado com tiopental sódico (100 mg/ kg), os olhos foram enucleados e preservados em RNA later a 4º C. O RNA total foi extraído a partir das retinas homogeneizadas, e convertido em DNA complementar (cDNA). Os genes de opsinas foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando primers específicos. Os produtos da PCR foram visualizados em gel de agarose (1%), purificados e sequenciados por sequenciamento Sanger. A identidade de cada gene foi confirmada com uso da ferramenta BLASTn e a partir de análises filogenéticas. O max de cada pigmento visual foi estimado a partir dos aminoácidos presentes em posições importantes para o deslocamento espectral descritos na literatura. Estes valores de max foram corrigidos considerando o deslocamento causado pelo uso do cromóforo 3,4-dehidroretinal, com base em curvas de calibração desenvolvidas a partir de valores de max medidos em opsinas com ambos os tipos de cromóforos. Para todos os fotopigmentos a estimativa do max foi próxima dos valores descritos em estudos prévios: SWS1 = 374 nm, SWS2 = 456 nm, RH1 = 518 nm, RH2 = 519 nm, e LWS = 617 nm. Os modelos computacionais foram elaborados a partir da técnica de modelagem comparativa (MC) e modelagem por threading. O espectro de absorção foi analisado com o auxílio do software ORCA segundo o método TD-DFT, aplicando-se a base de cálculo funcional B3LYP e 6-31G. Todos os modelos apresentaram boa qualidade estrutural, com mais de 90% dos aminoácidos dispostos em regiões altamente favoráveis, de acordo com o diagrama de Ramachandran. Para cada modelo, foram realizados estudos de docagem molecular para verificar o melhor posicionamento da estrutura do cromóforo na proteína. O max estimado com base nos modelos computacionais foram coerentes com o max da rodopsina, 517 nm, porém apresentou diferenças em relação às opsinas de cones: SWS1 = 400 nm, SWS2 = 437 nm, RH2 = 500 nm, e LWS = 627 nm. Estas diferenças podem ser resultantes da abordagem computacional utilizada, em que apenas aminoácidos distantes até 4 angströms do cromóforo foram considerados. Este trabalho estabeleceu uma equação capaz de determinar o max de pigmentos visuais baseados no uso da vitamina A2, e mostrou que as estimativas de max baseadas nos aminoácidos nos resíduos de deslocamento espectral das cinco opsinas foram coerentes com registros de microespectrofotometria e eletrofisiologia. Embora as estimativas de max obtidas a partir dos modelos computacionais tenham apresentado inconsistências, as análises in silico foram promissoras e possibilitam a aplicação de uma nova abordagem metodológica para investigações futuras da sensibilidade espectral de vertebrados
Título em inglês
Not informed by the author
Palavras-chave em inglês
11-cis-3
11-cis-retinal
4-dehidroretinal
fotorreceptores
Opsinas
Retina
Trachemys scripta elegans
Resumo em inglês
The visual system of vertebrates is responsible for capturing and processing light information from the environment. This process begins in the retina with the absorption of photons by the visual photopigments, located in the outer segments of the photoreceptors, cones, and rods. The visual pigments are G protein-coupled receptors, opsins, and rhodopsins, bound to a prosthetic photosensitive molecule, the retinal, derived from vitamin A1, and in some species, the 3,4-dehydroretinal, derived from vitamin A2. The interaction of the chromophore with specific amino acid residues of the protein determines the spectral absorption band and respective maximum wavelength (max) of the visual pigment. Additionally, the replacement of the retinal chromophore by the 3,4-dehydroretinal causes a bathochromic shift of the max of the visual pigments. The freshwater red-eared turtle, Trachemys scripta elegans, is known to use the 3,4-dehydroretinal and to express the five classes of visual pigments of vertebrates, the rhodopsin, RH1, in rods, with max at 518 nm, and four cone-opsins in different types of cones: SWS1 (max 372 nm), SWS2 (max 458 nm), RH2 (max 518 nm), and LWS (max 617 nm). In this study, the five visual opsin genes expressed in retinas of T. s. elegans were sequenced, and the opsins max were predict based on the amino acid sequences and using computational models. This project was approved by the Ethical Committee in the Use of Animals, from the Psychology Institute, University of São Paulo (Protocol 5446131117). One adult specimen was euthanized with sodium thiopental (100 mg/kg), the eyes were enucleated and preserved in RNA later at 4º C. The total RNA was extracted from homogenized retinas and converted to complementary DNA. The opsin genes were amplified by polymerase chain reactions (PCR) using specific primers. The PCR products were visualized in agarose gel (1%), purified, and directly sequenced by Sanger sequencing. The identity of each opsin gene was confirmed by BLAST searches and phylogenetic analysis. The max of each visual pigment was estimated based on the amino acids located at known spectral tuning sites. These values have been corrected considering the shift caused by the use of the 3,4-dehydroretinal, based on calibration curves constructed from max values measured in opsins associated with both chromophore types. The predicted max of all visual pigments were close to the values measured in previous studies: SWS1 = 374 nm, SWS2 = 456 nm, RH1 = 518 nm, RH2 = 519 nm, and LWS = 617 nm. The computational models were elaborated by comparative modeling (MC) and threading modeling. The absorption spectrum was analyzed with ORCA software, according to the TD-DFT method, applying the functional calculation base B3LYP and 6-31G. All computational models had good structural quality, with more than 90% of the amino acids arranged in favorable regions according to the Ramachandran diagram. For each model, molecular docking studies were carried out to verify the best positioning of the chromophore structure in the protein. The estimated max based on computational models agreed with the max measured for rhodopsin, 517 nm, but had considerable differences for the cone opsins: SWS1 = 400 nm, SWS2 = 437 nm, RH2 = 500 nm, and LWS = 627 nm. These discrepancies might be resultant from the computational approach applied, in which only the amino acids located at 4 angstroms distance from the chromophore were considered for estimating the spectral peak. In conclusion, this study has established an equation capable of determining the max of visual pigments based on the use of vitamin A2 chromophore and our max predictions based on the amino acids at known spectral tuning sites were consistent with previous electrophysiological and microspectrophotometry data, for all visual photopigments. Although the max predictions from computational models had inconsistencies, the in silico analyses performed are promising, and opens up a new methodological approach for further investigations of vertebrates spectral sensitivity
 
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Data de Liberação
2023-02-08
Data de Publicação
2021-02-09
 
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