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Master's Dissertation
DOI
https://doi.org/10.11606/D.47.2021.tde-03122021-163219
Document
Author
Full name
Maria Julia Vilani Naman
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2021
Supervisor
Committee
Bonci, Daniela Maria Oliveira (President)
Assis, Leonardo Vinícius Monteiro de
Castrucci, Ana Maria de Lauro
Hauzman, Einat
Title in Portuguese
Expressão de melanopsina nas retinas de corujas com diferentes padrões de atividade diária
Keywords in Portuguese
Expressão gênica
Melanopsina
Ritmo circadiano
Strigiformes
Abstract in Portuguese
A melanopsina é um fotopigmento responsável por gerar uma série de respostas à luz nos organismos como a regulação do ritmo circadiano, reflexo pupilar e controle da temperatura corporal. Dois genes parálogos foram descritos, Opn4x e Opn4m, como responsáveis pela expressão da melanopsina. O papel de cada tipo de melanopsina na retina dos vertebrados ainda não está totalmente elucidado e observa-se uma diversidade de padrões de expressão deste fotopigmento em retinas de diferentes espécies de vertebrados. As corujas são um excelente modelo para o estudo do papel da melanopsina devido a diversidade de espécies e seus padrões de atividades diferenciados, com corujas de hábitos diurno, noturno e catemeral. O objetivo deste trabalho foi caracterizar a expressão da melanopsina em diferentes espécies de corujas da família Strigidae e Tytonidae: Athene cunicularia, Asio clamator, Glaucidium brasilianum, Megascops choliba e Tyto furcata, através de análises genéticas, filogenéticas e morfológicas. Os animais foram obtidos junto ao Instituto de Ciências Biológicas, da Universidade Federal de Minas Gerais e sacrificados com o fármaco pentobarbital sódico (50 mg/kg de peso) injetado por via intraperitoneal, seguido de guilhotina. As coletas foram realizadas no período de 11h30-12h30 no mês de agosto/2019. Os olhos foram enucleados e as retinas foram dissecadas para os estudos genéticos e morfológicos. Foi realizada a extração do RNA e a sua transcrição em cDNA. O cDNA foi utilizado na reação em cadeia da polimerase (PCR) com posterior sequenciamento para identificação dos genes de melanopsina expressos na retina das corujas. Para as análises quantitativas da expressão gênica foi realizada a técnica de PCR em tempo real. Os dados obtidos foram comparados por análise de variância (ANOVA ONE-WAY) seguida pelo teste de Tukey. A reconstrução filogenética foi obtida pela método de Máxima Verossimilhança (Maximum Likelihood, ML), utilizando o programa GARLI v.0.96. O suporte estatístico para os ramos foi obtido por boostrap não paramétrico. Nos estudos morfológicos, retinas íntegras das espécies A. cunicularia, G. brasilianum e T. furcata foram marcadas com anticorpos específicos para a melanopsina OPN4x e OPN4m, por imunohistoquímica e revelados com anticorpo secundário CY3. Os resultados genéticos mostraram que as corujas expressam os dois genes de melanopsina, Opn4x e Opn4m e as análises filogenéticas dos genes recuperou a filogenia das corujas, com separação de dois clados monofiléticos formados pelas famílias Strigidae e Tytonidae. Os resultados de PCR em tempo real mostraram uma variação no perfil de expressão dos genes entre as espécies noturnas, diurnas e catemerais. Nos resultados morfológicos foi observado que a melanopsina pode estar expressa na camada dos fotorreceptores (CF), na camada nuclear interna (CNI), na camada de células ganglionares (CCG), e na camada de fibras nervosas. Com base em todos os resultados obtidos, observa-se que em espécies com diferentes hábitos o padrão de melanopsina se difere e é possível inferir que os genes de melanopsina podem apresentar funções diferentes na retina de corujas. Os resultados apontam para a necessidade de novas pesquisas sobre a expressão gênica da melanopsina em corujas em outros períodos do dia, a fim de entendermos melhor como é o padrão de expressão ao longo do dia nestas espécies e sua relação com os diferentes padrões de atividade diária
Title in English
Not informed by the author
Keywords in English
Circadian rhythms
Gene expression
Melanopsin
Strigiformes
Abstract in English
Melanopsin is a photopigment responsible for generating a series of responses to light in organisms, such as circadian rhythm regulation, pupillary reflex and body temperature control. Two paralogous genes, Opn4x and Opn4m, were described as responsible for the expression of melanopsin. The role of each type of melanopsin in the vertebrate retina is still not fully elucidated and a diversity of expression patterns of this photopigment can be observed in retinas of different vertebrate species. Owls are an excellent model for studying the role of melanopsin due to the diversity of species and their different activity patterns, with owls with diurnal, nocturnal and cathemeral habits. The purpose of the study was to characterize the expression of melanopsin in different species of owls of the Strigidae and Tytonidae family: Athene cunicularia, Asio clamator, Glaucidium brasilianum, Megascops choliba, and Tyto furcata, through genetic, phylogenetic and morphological analyses. The animals were obtained from the Institute of Biological Sciences of the Federal University of Minas Gerais and sacrificed with the sodium pentobarbital (50 mg/kg of weight) injected intraperitoneally, followed by a guillotine. Collections were carried out from 11:30 am to 12:30 am in August/2019. The eyes were enucleated, and the retinas were dissected for genetic and morphological studies. RNA extraction and transcription cDNA were performed. The melanopsin cDNA was used in the polymerase chain reaction (PCR) with subsequent sequencing to identify melanopsin genes expressed in the retina of owls. For the quantitative analysis of gene expression, the real-time PCR was performed. Data were compared by analysis of variance (one-way ANOVA) followed by Tukey test. The phylogenetic reconstruction was obtained by the maximum likelihood method (Maximum Likelihood, ML) using the program Garli v.0.96. Statistical support for the branches was obtained by non-parametric boostrap. In morphological studies, retinas of the species A. cunicularia, G. brasilianum and T. furcata were labeled with specific antibodies for melanopsin OPN4x and OPN4m, by immunohistochemistry and revealed with secondary antibody CY3. The results showed that the genetic owls express both genes of melanopsin, Opn4x Opn4m, and phylogenetic analysis of the gene recovered phylogeny of owls, with separation of two monophyletic clades formed by Strigidae and Tytonidae families. Real-time PCR showed a variation in expression pattern between nocturnal, diurnal and catameral species. In the morphological results, it was observed that melanopsin can be expressed in the photoreceptor layer (PL), in the inner nuclear layer (INL), in the ganglion cell layer (GCL), and in the nerve fiber layer (NFL). Based on all the results obtained, it is observed that in species with different habits the melanopsin pattern differs and it is possible to infer that melanopsin genes may have different functions in the retina of owls. The results point to the need for further research on the gene expression of melanopsin in owls at other times of the day, to better understand the pattern of expression throughout the day in these species and its relationship with different patterns of activity daily
 
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Publishing Date
2021-12-06
 
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