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Dissertação de Mestrado
DOI
https://doi.org/10.11606/D.46.2021.tde-26042022-083934
Documento
Autor
Nome completo
Raphael de Avila Narciso Gomes
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2021
Orientador
Banca examinadora
Baptista, Mauricio da Silva (Presidente)
Kurachi, Cristina
Tasso, Thiago Teixeira
Título em inglês
Photosensitization in membrane models and in neuronal cells
Palavras-chave em inglês
DMMB
Lipid membranes
Neuronal cells
Photodynamic therapy
Photosensitization
Ruthenium complexes
Resumo em inglês
Photodynamic therapy (PDT) is being extensively studied and tested to treat different types of diseases, such as cancer, leishmaniosis, malaria, among others. PDT usually comprises the use of photosensitizers, oxygen and light to increase the oxidative stress in cells and tissues. Preferred photosensitizers display: i) high absorption coefficient in the visible range of the light spectra; ii) high efficiency of triplet excited state generation with energy suitable to allow efficient energy transfer to form singlet oxygen; iii) physical-chemical and biochemical properties that allow interaction with important biological targets. Usually organic compounds, such as porphyrin or phenothiazinium derivatives, are used as photosensitizers (PS), but ruthenium complexes are also promising compounds to function as PDT PS. In this work the photodynamic effects of ruthenium photoactive complexes were evaluated in membrane small unilamellar vesicles (SUVs) and giant unilamellar vesicles (GUVs) and in a cellular model (Mouse Hippocampal Neuronal Cell Line - HT22). The phototoxicity of the complexes in HT22 cells were analysed, and the photochemical damage in the cell and mitochondria was observed by flow cytometry and microscopy. Experiments were also designed to compare its efficiency with an efficient phenothiazinium (dimethyl-methylene blue DMMB). The ruthenium complexes were able to damage the membranes of GUVs and SUVs and the damage efficiency does not seem to be related to the efficiency of singlet oxygen generation, but to membrane bonding. In HT22 cells Ru complexes were able to damage mitochondria. Damage could not be reverted by general anti-oxidant agents. The LD50 were calculated to be from 17 to 25 M from 8000 to 25000 cells, which implicates in intracellular concentrations of ~80pM/cell. DMMB also causes severe damage in mitochondria as indicated by mitochondria morphology, mitoSox staining, and lipid peroxidation. The LD50 were calculated to be 30 to 35 and 40 nM for incubations with 5000, 6000 and 8000 cells, respectively, which implicates in intracellular concentrations of ~2pM/cell. It is clear that DMMB is more efficient (~40 times) in terms of causing cell death (compared PS intracellular concentrations at the LD50), probably because for its higher tendency to bind more efficiently to membranes. We expect to have higher efficiency in Ru complexes with more lipophilic ligands.
Título em português
Fotossensibilização em modelos de membrana e células neuronais
Palavras-chave em português
Células neuronais
Complexos de rutênio
DMMB
Fotossensibilização
Membranas
Terapia fotodinâmica
Resumo em português
A terapia fotodinâmica (TFD) está sendo amplamente estudada e testada para tratar diversos tipos de doenças, como câncer e doenças infecciosas. A TFD geralmente consiste no uso de fotossensibilizadores, oxigênio e luz para aumentar o estresse oxidativo em células e tecidos. Os fotossensibilizadores preferidos exibem: i) alto coeficiente de absorção na faixa visível do espectro luminoso; ii) alta eficiência de geração de estado excitado tripleto com energia adequada para permitir transferência de energia eficiente para formar oxigênio singlete; iii) propriedades físico-químicas e bioquímicas que permitam a interação com importantes alvos biológicos. Normalmente, compostos orgânicos, como porfirina ou derivados de sais fenotiazínicos, são usados como fotossensibilizadores (FS), mas complexos de rutênio também são compostos promissores para funcionar como fotossensibilizadores em TFD. Neste trabalho os efeitos fotodinâmicos dos complexos fotoativos de rutênio foram avaliados em modelos de membranas, ou seja, vesículas unilamelares pequenas (SUVs) e em vesículas unilamelares gigantes (GUVs), e em um modelo celular (Linha de Células Neuronais Hipocampais de Rato - HT22). A fototoxicidade dos complexos em células HT22 foi analisada, e o dano fotoquímico na célula e na mitocôndria foi observado por citometria de fluxo e microscopia. Os experimentos também foram projetados para comparar sua eficiência com um fenotiazínio eficiente (azul de 1,9-dimetilmetileno, DMMB). Os complexos de rutênio foram capazes de causar dano às membranas de GUVs e SUVs e a eficiência de dano não parece ter relação com a eficiência de geração de oxigênio singlete, mas sim com a ligação em membranas. Em células HT22, os complexos de rutênio foram capazes de danificar as mitocôndrias. Os danos não podem ser revertidos por agentes antioxidantes gerais. O LD50 foi calculado como sendo de 17 a 25 M de 8.000 a 25.000 células, o que implica em concentrações intracelulares de ~80pM / célula. O DMMB também causa danos graves nas mitocôndrias, conforme indicado pela morfologia das mitocôndrias, coloração com MitoSox e peroxidação lipídica. O LD50 foi calculado em 30 a 35 e 40 nM para incubações com 5.000, 6.000 e 8.000 células, respectivamente, o que implica em concentrações intracelulares de ~2pM / célula. Foi observado que o DMMB é mais eficiente (~40 vezes) na diminuição de viabilidade celular (comparadas às concentrações intracelulares de PS no LD50), provavelmente devido à sua maior tendência para se ligar de forma mais eficiente às membranas. Esperamos ter maior eficiência em complexos de rutênio com mais ligantes lipofílicos.
 
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Data de Publicação
2022-06-07
 
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