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Tesis Doctoral
DOI
10.11606/T.46.2014.tde-20012015-145249
Documento
Autor
Nombre completo
Lidiane da Silva Araújo
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2014
Director
Tribunal
Andrade, Leandro Helgueira de (Presidente)
Moreno, Paulo Roberto Hrihorowitsch
Porto, Andre Luiz Meleiro
Silva, Márcio Santos da
Stevani, Cassius Vinicius
Título en portugués
Estudo de oxidorredutase da Arthrobacter sp. isolada de sedimento marinho antártico
Palabras clave en portugués
Desracemização
Hetero-átomos
Oxidorredutase
Psicrofílico
Purificação
Redução enantiosseletiva
Resumen en portugués
Inspirados em reações catalisadas por enzimas a partir de micro-organismos encontrados em ambientes marinhos severos (psicrofílicos), em que a quantidade de oxigênio é restrita, observou-se que a Arthrobacter sp. CCT 7749 realizou diferentes transformações químicas mudando de condições reacionais anaeróbias para aeróbias. Dependendo da presença ou ausência de oxigênio, ambas desracemização de alcoóis ou redução de cetonas com seletividades enantiocomplementares foram realizadas pelo mesmo microorganismo. Estes conceitos foram aplicados tanto para desracemização quanto para redução enantiosseletiva de compostos contendo heteroátomos (silício, fósforo, estanho e boro). Visando a identificação molecular das enzimas responsáveis pelas reações de oxido-redução, buscou-se desenvolver uma metodologia de purificação enzimática usando diferentes técnicas. Inicialmente a lise celular da Arthrobacter sp. CCT 7749 empregando a liticase na presença de β-mercaptoetanol e usando ondas ultrassônicas produziu 28 mg/mL de proteínas. A purificação da oxidorredutase ocorreu através de colunas cromatográficas de troca iônica DEAE FF, seguida por ANX FF. O extrato protéico contendo a enzima parcialmente pura apresentou atividade específica de 4,23 U/mg na oxidação do (R,S)-1-(4-metilfenil)etanol à cetona correspondente. Através do uso das técnicas native-PAGE e zimografia detectou-se uma massa molecular da enzima de ≈240 kDa e que provavelmente se encontrava na forma hetero-hexamérica apresentando três subunidades em ~35 kDa e três em ~45 kDa. Observou-se que, surpreendentemente, a fração protéica parcialmente pura também foi capaz de reduzir a 4-metilacetofenona obtendo-se 17% do (S)-1-(4-metilfenil)etanol com excelente excesso enantiomérico >99%.
Título en inglés
Studies of oxidoreductase produced by Arthrobacter sp. isolated from Antarctic marine sediment
Palabras clave en inglés
Alcohol deracemization
Enantioselective reduction
Heteroatoms
Oxidoreductase
Psychrophilic
Purification
Resumen en inglés
Inspired by enzyme-catalyzed reactions with microorganisms found in harsh marine environments (psychrophilic), in which the amount of oxygen is restrict, we have shown that Arthrobacter sp. CCT 7749 can perform different chemical transformations by switching from anaerobic to aerobic reaction conditions. Depending on the presence or absence of oxygen, either alcohol deracemization or ketone reduction with enantiocomplementary selectivities can be performed by the same microorganism. These concepts were applied for both deracemization and enantioselective reduction of heteroatom-containing molecules (silicon, phosphorus, tin and boron). Aiming Enzyme purification, different techniques were employed. Cell lysate of Arthrobacter sp. CCT 7749. Was prepared using lyticase and β-mercaptoethanol bu ultrasonication. Purification of this enzyme occurred through chromatographic columns of DEAE FF ion exchange, followed by ANX FF. The partially pure oxidoreductase presented specific activity of 4.23/mg in the oxidation (RS)-1-(4- methylphenyl)ethanol to the corresponding ketone. Native-PAGE and zymography have shown that the enzyme had ≈240 kDa molecular mass, probably in the form hetero-hexameric with 3 subunits ~35 kDa and three ~45 kDa. Surprisingly, the partially pure protein fraction was able to reduce the 4- methylacetophenone giving 17% of (S)-1-(4-methylphenyl)ethanol with excellent enantiomeric excess >99%.
 
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Fecha de Publicación
2015-02-11
 
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