As enzimas têm sido amplamente estudadas porque são essenciais para a ocorrência das transformações bioquímicas em seres vivos e exigidas em diversos setores da indústria. Em geral, os seus estudos de análise estrutural, modo de ação, inibição, mutação e modificação química (que inclui imobilização) tem o intuito de melhor entendê-las e, se possível, aprimorá-las ou evoluí-las. O presente trabalho visou desenvolver novos nanobiocatalisadores (NBCs) magnéticos proteolíticos, estudá-los e aplicá-los em proteólise e síntese de dipeptídeos. Assim, imobilizamos as endopeptidases termolisina bacteriana (TLN) e tripsina pancreática bovina (TRY) em nanopartículas de magnetita revestidas de sílica aminada (Fe₃O₄@sílica-NH₂). Os Fe₃O₄@sílica-TLN e Fe₃O₄@sílicaTRY obtidos foram caracterizados em: atividade específica, recuperação dos meios reacionais, parâmetros cinéticos, estabilidade química, estabilidade térmica, pH ótimo e reuso, como fizemos com o Fe₃O₄@sílica-α-quimotripsina pancreática bovina (Fe₃O₄@sílica-α-QT) que desenvolvemos e estudamos anteriormente. Apesar de serem observadas quedas de atividade específica e dos valores dos parâmetros cinéticos pela imobilização por ligação covalente, todos os NBCs foram facilmente recuperáveis, suas estabilidades química e térmica foram aumentadas e eles puderam ser reutilizados por até 10 vezes. A aplicabilidade dos três novos NBCs em proteólises foi demonstrada usando as caseínas do leite bovino (X), uma fonte de peptídeos bioativos, e albumina do soro bovino (Y), uma proteína modelo. Em 24 h de incubação, foram detectados por LCMS fragmentos peptídicos de X e Y nos seguintes totais, respectivamente: 84 e 48 (Fe₃O₄@sílica-TLN); 34 e 28 (Fe₃O₄@sílica-TRY); 29 e 24 (Fe₃O₄@sílica-α-QT). Do total geral (247) de peptídeos, 64 indicaram potencial de bioatividade por semelhança de sequência de aminoácidos com as de peptídeos bioativos conhecidos. Por ser um processo de interesse industrial, a proteólise seguida de coagulação do leite catalisada pela Fe₃O₄@sílica-TLN também foi tentada e obtido sucesso, sendo o NBC reutilizado por 11 ciclos reacionais. Fe₃O₄@sílica-TLN e Fe₃O₄@sílica-α-QT ainda foram examinadas na aplicabilidade em síntese biocatalisada de dipeptídeos, opção enantioseletiva e mais limpa à síntese química. Usando rota sintética estabelecida por nós, foram estudadas as sínteses de: Ala-Phe (apresenta sabor amargo), Asp-Phe-OMe (apresenta sabor doce), Phe-Phe e Fmoc-Phe-Phe (apresentam propriedades gelificantes). A formação da ligação peptídica catalisada pela TLN livre ocorreu com rendimentos reacionais superiores (73- 85 %) aos obtidos com a Fe₃O₄@sílica-TLN nos casos das sínteses de Z-Ala-Phe-OMe, Z-Asp-Phe-OMe e Z-Phe-Phe-OMe (26-52 %), mas comparável no caso da síntese de Fmoc-Phe-Phe-OMe (72 %). A hidrólise do éster dos Z-Ala-Phe-OMe, Z-Phe-Phe-OMe e Fmoc-Phe-Phe-OMe catalisada por Fe₃O₄@sílica-α-QT ocorreu com altos rendimentos (72-91%). De forma inédita, a remoção do grupo protetor benziloxicarbonil (Z) por hidrogenação catalisada pelo nanocatalisador magnético Fe₃O₄@sílica-Pd forneceu os Ala-Phe, Asp-Phe-OMe e Phe-Phe desejados com 74, 81 e 70 %. Os NBCs e o Fe₃O₄@sílica-Pd se mostraram facilmente recuperáveis dos meios reacionais e reutilizáveis por 1-10 vezes. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que os objetivos traçados foram atingidos, pois novos NBCs proteolíticos magnéticos e uma rota sintética verde foram desenvolvidos, obtidos e aplicados em proteólises e sínteses de peptídeos. Esses são processos biotecnológicos importantes no sequenciamento proteico, na indústria alimentícia e na geração/produção de peptídeos bioativos.

Enzymes are extensively studied because of their involvement in biochemical transformations and are needed in various sectors of the industry. In general, the studies focused on enzyme structural analysis, mode of action, inhibition, mutation, and chemical modification (including immobilization) intend a better understanding of these biocatalysts and, if possible, improvement of their properties or direct-evolution. This study aimed to develop new proteolytic magnetic nanobiocatalysts (NBCs) to study and apply them in proteolysis and dipeptide synthesis. Thus, we immobilized the endopeptidases bacterial thermolysin (TLN) and bovine pancreatic trypsin (TRY) on nanoparticles of magnetite coated by aminated silica (Fe₃O₄@silica-NH₂). The Fe₃O₄@sílica-TLN e Fe₃O₄@sílicaTRY obtained had examined their specific activity, recovery from reaction media, kinetic parameters, chemical and thermal stabilities, optimum pH and reusability, as we did for Fe₃O₄@silica-α-bovine pancreatic chymotrypsin (Fe₃O₄@sílica-α-CT) developed and studied earlier. Although specific activity and the kinetic parameters values decreased, chemical and thermal stabilities increased and ease recovery was confirmed. In addition, the new NBCs could be reused 10 times without significant loss of catalytic activity. The applicability of the three magnetic NBCs on proteolysis was demonstrated using bovine milk casein (X), a food source of bioactive peptides, and bovine serum albumin (Y), a model protein. Indeed, incubation for 24 h generated the following numbers of peptide fragments from X and Y, respectively, detectable by LC-MS: 84 and 48 (Fe₃O₄@sílicaTLN); 34 and 28 (Fe₃O₄@sílica-TRY); 29 and 24 (Fe₃O₄@sílica-α-QT). From the total number (247), 64 are likely to be bioactive as they presented high sequence homology to known bioactive peptides. Since proteolysis followed by milk coagulation is an industrial process of great interest, Fe₃O₄@sílica-TLN was also employed for this purpose showing to be suitable and reusable up to 10 cycles. Fe₃O₄@sílica-TLN and Fe₃O₄@sílica-α-QT were also employed as catalyst in dipeptide synthesis, an enantioselective and clean alternative to the chemical method. The syntheses of Ala-Phe (a bitter peptide), Asp-PheOMe (a sweet peptide), Phe-Phe and Fmoc-Phe-Phe (gel-forming peptides) could be accomplished using a synthetic route previously established by us. Peptide bond formation catalyzed by free TLN yielded more product (reaction yields of 73-85 %) than that catalyzed by Fe₃O₄@sílica-TLN in the cases of Z-Ala-Phe-OMe, Z-Asp-Phe-OMe and ZPhe-Phe-OMe (26-52 %), but not in the case of Fmoc-Phe-Phe-OMe (72 %). Esther hydrolysis of Z-Ala-Phe-OMe, Z-Phe-Phe-OMe and Fmoc-Phe-Phe-OMe catalyzed by Fe₃O₄@sílica-α-QT gave high reaction yields (72-91%). The pioneering removal of the benziloxycarbonyl (Z) protecting group by hydrogenation catalyzed by Fe₃O₄@sílica-Pd yielded 74, 81 or 70 % of Ala-Phe, Asp-Phe-OMe or Phe-Phe, respectively. In all cases, the NBCs and the Pd-nanocatalyst could be efficiently recovered from the reaction media and reused (1-10 times). From these results, we can conclude that our goal was achieved because new proteolytic magnetic NBCs were developed, studied and successfully applied to proteolysis as well as to green dipeptide synthesies. These are biotechnological processes critical in protein sequencing, food industry, and generation/production of bioactive peptides.