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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.46.2008.tde-21072008-141047
Document
Author
Full name
Lizandra Belmonte Rodrigues de Castro
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2008
Supervisor
Committee
Petri, Denise Freitas Siqueira (President)
Alcantara, Maria Regina
Pessoa Júnior, Adalberto
Ribeiro, Ana Maria Carmona
Salvadori, Maria Cecília Barbosa da Silveira
Title in Portuguese
Imobilização de proteínas sobre superfícies de polissacarídeos
Keywords in Portuguese
Adsorção
Microscopia de força atômica
Polissacarídeos
Proteínas
Abstract in Portuguese
Esta tese apresenta o estudo inédito da obtenção e caracterização de filmes finos de xiloglucanas obtidas de duas fontes diferentes, Hymenaea courbaril (HXG) e Tamarindus indica (TXG) sobre lâminas de Si/SiO2 e lâminas modificadas com grupos amino, assim como a aplicação desses filmes na imobilização da lectina concanavalina A (Con A) por medidas de elipsometria e microscopia de força atômica (AFM). A diferença na estrutura fina de cada XG influenciou na espessura e morfologia de seus filmes finos. Os oligômeros XXXXG presentes apenas na HXG favorecem as interações com a superfície, assim como já observado para interação entre XG-celulose [Lima e Buckeridge, 2001]. A imobilização de Con A foi realizada sobre filmes de carboximetilcelulose (CMC) de HXG, TXG e poli(metacrilato de metila) (PMMA), lâminas de Si/SiO2 e partículas poliméricas decoradas com polissacarídeo PMMA/CMC. A adsorção de Con A foi mais pronunciada sobre os filmes de CMC. As camadas de Con A formadas sobre HXG e TXG apresentam potencial utilização no reconhecimento e detecção de carboidratos para desenvolvimento de diagnósticos para algumas doenças, por não comprometerem o sítio de ligação específica da lectina na adsorção. No caso das partículas PMMA/CMC cobertas com uma camada de Con A, a alta estabilidade coloidal do sistema confere às partículas a possibilidade de explorar a propriedade de aglutinação específica da lectina no reconhecimento de carboidratos. A enzima hexoquinase (HK) foi imobilizada sobre dois diferentes tipos de partículas poliméricas decoradas com polissacarídeo, PMMA/CMC e poliestireno/quitosana (PS/CH). Na primeira, HK perdeu drasticamente sua atividade catalítica, ao contrário do observado quando a mesma enzima foi imobilizada sobre PS/CH, onde a HK manteve aproximadamente 50% de sua atividade enzimática, podendo ser armazenada em temperatura e pressão ambientes por 1 mês e ser reutilizada até 3 vezes. A estrutura da camada de hidratação e a composição química de cada um dos polissacarídeos (CMC ou CH) na superfície das partículas são diferentes, provocando diferenças na conformação das moléculas de HK quando imobilizadas sobre cada tipo de partícula. Medidas de forças de adesão utilizando as partículas poliméricas coladas na extremidade de cantilevers de AFM (Colloidal Probe Technique) permitiram medir as espessuras dessas camadas hidratadas de polissacarídeos nas superfícies das partículas PMMA/CMC e PS/CH, da ordem de (20 ± 10) nm e (35 ± 11) nm, respectivamente. Essas medidas de força também evidenciaram o potencial dos dois sistemas estudados (PMMA/CMC - Con A e PS/CH - HK) como métodos qualitativos para a detecção dos açúcares manose, glicose e frutose.
Title in English
Immobilization of proteins onto polysaccharide surfaces
Keywords in English
Adsorption
Atomic force microscopy
Polysaccharides
Proteins
Abstract in English
This thesis presents the study on thin film formation and characterization of xyloglucans extracted from two different sources, Hymenaea courbaril (HXG) and Tamarindus indica (TXG) onto Si/SiO2 wafers or amino-terminated wafers, as well as the application of these films as substrates for the immobilization of the lectin concanavalin A (Con A) by means of ellipsometry and atomic force microscopy (AFM). The difference in the fine structure of each XG exerted influence on film thickness and morphology. The oligomers XXXXG present only in HXG favor the interactions with the surfaces, as already observed for the interaction between XG-cellulose [Lima and Buckeridge, 2001]. Con A was immobilized onto films of carboxymethylcellulose (CMC), HXG, TXG and poly(methyl methacrylate) (PMMA), Si/SiO2 wafers and on polysaccharide decorated polymeric particles PMMA/CMC. The adsorption of Con A was more pronounced on CMC films. Con A layers formed on HXG and TXG present potential application in the recognition and detection of carbohydrates for diagnostic development, once the specific sugar binding site is not involved in the adsorption process. In the case of polymeric particles PMMA/CMC covered with a Con A layer, the high colloidal stability of the system confers to particles the possibility to explore the lectin property of specific agglutination with carbohydrates. The enzyme hexokinase (HK) was immobilized onto two different types of polysaccharide decorated polymeric particles, PMMA/CMC and polystyrene/chitosan (PS/CH). In the first one, HK drastically lost its catalytic activity. The same enzyme immobilized onto PS/CH kept approximately 50% of its enzymatic activity, even after storing under room temperature and pressure for 1 month. Moreover upon immobilizing HK could be reused up to 3 times. The structure of the hydration layer and the chemical composition due to the presence of each polysaccharide (CMC or CH) on the polymeric particle surface provided different environment, generating differences in the conformation of immobilized molecules of HK on each particle. Measurements of adhesion forces using the polymeric particles glued on the extremity of AFM cantilevers (Colloidal Probe Technique) allowed to measure the thicknesses of these hydrated polysaccharide layers on the surfaces of the PMMA/CMC and PS/CH particles as (20 ± 10) nm and (35 ± 11) nm, respectively. These force measurements had also evidenced the potential of the two studied systems (PMMA/CMC - Con A and PS/CH - HK) as qualitative methods for detection of the sugars mannose, glucose and fructose.
 
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Publishing Date
2008-08-04
 
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