This thesis studied the oxidation of uric acid during inflammation and its role in uric acid associated-pathologies . Uric acid is the end product of purine metabolism in humans and primates. Its concentration in plasma is higher than in other mammals, due to the repression of uricase gene. This repression was considered an evolutionary advantage since accumulation of uric acid in plasma increases the total blood antioxidant capacity. On the other hand, increased plasma uric acid has been associated with hypertension, gout, atherosclerosis and a worse prognosis in infection. Although the pathogenesis of these diseases is extremely complex and poorly understood, these associations suggest a causal role for uric acid. However, the exact mechanism for it is still unclear. Our group showed recently that uric acid is a substrate for myeloperoxidase, a heme-peroxidase abundant in neutrophils. The oxidation of uric acid by the enzyme generates urate free radical that combines with the radical anion superoxide to generate the oxidant urate hidroperoxide. Since chloride is the main substrate for myeloperoxidase, the present study aimed to investigate whether urate hidroperoxide would be formed during the oxidative burst in neutrophils. Through the sensitive liquid chromatography coupled to mass spectrometry method, we demonstrated the formation of urate hidroperoxide by peripheral blood neutrophils activated with phorbol miristate acetate, mimicking an inflammatory stimulus. Thus, we confirmed our hypothesis and demonstrated, for the first time, the formation of this new oxidant in inflammation. . The presence of uric acid during the inflammatory oxidative burst increased the oxidation of glutathione and the production of the radical anion superoxide, promoting a more oxidative environment. Besides the urate hydroperoxide, the oxidation of uric acid generates other intermediates that reactwith lysine residues to form covalent adducts in albumin, a process named uratylation.. These urate covalent adducts, as well as the end product of uric acid oxidation, allantoin, were elevated in plasma albumin from patients with heart failure and diabetes. Therefore, allantoin and uratylated peptides from albumin could be useful biomarkers of inflammatory and cardiovascular diseases. The oxidation of uric acid by neutrophils decreases the production of hypochlorous acid due to the competition between uric acid and chloride by myeloperoxidase and this hinders the microbicide activity of these cells against Pseudomonas aeruginosa, as previously demonstrated by our group. In the present study we demonstrated that the oxidation of uric acid is also more pronounced in patients with septicaemia. There was a significant augment of plasma allantoin and an uratylated peptide from albumin in these patients compared to health individuals. By incubating peripheral blood neutrophils with uric acid and Pseudomonas aeruginosa we detected in increase in allantoin, in the oxidation of glutathione and glutathionylation of the microbicide protein calprotectin (S100A8). Uric acid also increased total neutrophil triacylglycerols (TAGs), including those sterified with araquidonic acid. These data suggest that, in infectious processes, uric acid may indirectly affect protein function through the induction of glutathionylation and can also remodel lipid constitution in inflammatory cells. These alterations may have a relevant role in the pathogenesis of sepsis and could explain, at least in part, the worse correlation between sepsis and higher levels of plasma uric acid.In this context, we propose the assessment of allantoin and uratylated albumin peptides as useful tools to monitor the progression of infectious and inflammatory diseases

Essa tese estuda a oxidação do ácido úrico durante a inflamação e o seu papel em patologias associadas ao ácido úrico. O ácido úrico é o produto final do metabolismo de purinas em humanos e primatas. Sua concentração no plasma é mais elevada do que em outros mamíferos, devido à repressão do gene da enzima que o decompõe, a uricase. Essa repressão foi considerada uma vantagem evolutiva, devido ao caráter antioxidante do ácido úrico. Por outro lado, níveis aumentados de ácido úrico no plasma têm sido associados à hipertensão, gota, aterosclerose e um pior prognóstico em doenças infecciosas. Embora a patogênese destas doenças seja extremamente complexa e pouco compreendida, estas associações sugerem um papel causal do ácido úrico nestas patologias. Entretanto, o exato mecanismo do papel do ácido úrico nessas patologias ainda não está bem esclarecido. Nosso grupo já havia demonstrado que o ácido úrico é um substrato para a mieloperoxidase, uma heme peroxidase abundante em neutrófilos, e que a combinação do produto desta oxidação, o radical livre de urato, com o radical ânion superóxido gera o oxidante hidroperóxido de urato. Uma vez que o cloreto é o principal substrato à mieloperoxidase, um dos objetivos desta tese foi investigar se a formação do hidroperóxido de urato ocorreria mediante o burst oxidativo de neutrófilos, uma condição onde há vários substratos para a enzima e mais próxima ao fisiológico. Nesse sentido, através de um método sensível de cromatografia liquida acoplada à espectrometria de massas, nós demonstramos que mediante a ativação de neutrófilos de sangue periférico, mimetizando um estímulo inflamatório, há formação do hidroperóxido de urato, comprovando de forma inédita a formação deste oxidante na inflamação. A presença do ácido úrico durante o burst oxidativo inflamatório aumentou a oxidação da glutationa e a produçãodo radical ânion superóxido, ocasionando um ambiente celular mais oxidativo. Além do hidroperóxido de urato, a oxidação do ácido úrico gera outros intermediários capazes de formar adutos covalentes em resíduos de lisina da albumina. Nesta tese quantificou-se, através de espectrometria de massas, os níveis destes adutos em plasma, verificando-se um aumento bastante significativo, juntamente com o produto final da oxidação do ácido úrico, a alantoína, em plasmas de paciente com insuficiência cardíaca e diabetes. A formação destes adutos pode modificar a função da albumina e estar relacionada à patologia vascular nestes pacientes. Além disso, os peptídeos uratilados da albumina tem potencial uso como biomarcadores nestas doenças inflamatórias. A oxidação do ácido úrico pelos neutrófilos diminui a produção de ácido hipocloroso devido à competição entre o ácido úrico e o cloreto pela mieloperoxidase e isso atenua a atividade microbicida dessas células contra Pseudomonas aeruginosa, como demonstrou um trabalho do nosso grupo. No presente trabalho, nós demonstramos que a oxidação do ácido úrico também está mais acentuada em pacientes com septicemia. Quando comparado aos indivíduos saudáveis houve um aumento significativo nos níveis plasmáticos de alantoína e de um peptídeo uratilado da albumina. A infecção de neutrófilos isolados de sangue periférico com Pseudomonas aeruginosa na presença de ácido úrico levou a um aumento nos níveis de alantoína, oxidação da glutationa e glutationilação de proteínas com função microbicida como a calprotectina (S100A8). O ácido úrico também induziu um aumento de triacilgliceróis (TAGs) em neutrófilos, incluindo TAGs esterificados ao ácido araquidônico. Desta forma, concluímos que, em processos infecciosos, o ácido úrico afeta de forma diferencial a função de algumas proteínas, através da indução da glutationilação e pode remodelar a constituição lipídica de células inflamatórias. É possível que estas alterações tenham um papel relevante na patogênese da doença infecciosa e poderiam explicar, pelo menos em parte, o pior prognóstico encontrado entre os níveis plasmáticos de ácido úrico na sepse. Neste sentido, a medida dos níveis de alantoína e peptídeos uratilados da albuminapodem ser uma ferramenta útil no monitoramento da progressão de doenças infecciosas e inflamatórias