O adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é uma doença altamente letal, com sobrevida média de 6 meses e sobrevida global de 5 anos em menos de 7% dos casos. Uma possível razão para esta letalidade é que o mecanismo oncogênico mais comum em PDAC, apresentando-se em até 90% dos pacientes, é a ativação constitutiva da GTPase KRAS por mutações oncogênicas; e apesar de KRAS ser um alvo terapêutico racional, até o presente nenhuma terapia efetiva para neoplasias induzidas por KRAS chegou à clínica. Portanto, um melhor entendimento das vias oncogênicas desencadeadas por KRAS mutante em PDAC é necessário. O nosso projeto teve como objetivo identificar alvos moleculares da KRAS que contribuem para o fenótipo maligno. Portanto, investigamos duas vias oncogênicas dependentes de KRAS pouco exploradas: No Capítulo 1, investigamos a quinase Aurora A (AURKA) e seu ativador TPX2 como alvos terapêuticos para o PDAC; e no Capítulo 2 realizamos a análise funcional de microRNAs (miRNAs) regulados por KRAS em PDAC. No capítulo 1, uma análise de RNAseq e qPCR de amostras de pacientes com PDAC mostrou que, os tumores pancreáticos apresentaram uma expressão significativamente aumentada de AURKA e TPX2. Em seguida, usando conjuntos de dados públicos (TCGA e ICGC), observamos que a AURKA e TPX2 são co-expressos em PDAC, além do mais a expressão elevada de AURKA ou TPX2 estão associadas com menor sobrevida e com a presença de mutações em KRAS. Ademais, a inibição de KRAS por interferência de RNA em células pancreáticas KRAS-mutantes reduziu os níveis de AURKA e TPX2, confirmando que ambos são alvos de KRAS no PDAC. Finalmente, a inibição farmacológica de AURKA em células de PDAC reduziu a viabilidade e proliferação celular. Semelhantemente, o silenciamento de AURKA ou TPX2 reduziu a clonogenicidade, o crescimento independente de ancoragem e migração celular. Estes resultados apoiam a hipótese de que a AURKA e o TPX2 são alvos promissores a serem explorados terapeuticamente no PDAC. No Capítulo 2, demos continuidade a um estudo realizado anteriormente no laboratório, através de ensaios de microarranjo de DNA para comparar a expressão de miRNAs em células epiteliais pancreáticas isogênicas, que diferem apenas pela expressão da forma oncogênica da KRAS, foram identificados 19 miRNAs com expressão aumentada em função de KRAS. Primeiro, usando Ingenuity Pathways Analysis, identificamos que o alvo regulado por mais membros desta rede de miRNAs era a fosfatase PTEN, sendo alvo para 7 destes miRNAs. Corroborando este achado, o silenciamento de KRAS em células de PDAC aumentou os níveis proteicos de PTEN e diminuiu a expressão de 3 dos 7 miRNAs desta rede. Nós observamos também que a inibição farmacológica da via da PI3K/AKT ou MAPK não alterou nos níveis de PTEN, sugerindo que a regulação de PTEN por KRAS é independente destas vias. Mais importante, quando os miRNAs com regulação validada por KRAS foram silenciados individualmente, nós observamos, não só um aumento nos níveis proteicos de PTEN, mas também uma diminuição da viabilidade celular. Finalmente, a inibição combinada destes 3 miRNAs induziu morte celular. Em conclusão, nós identificamos uma assinatura de miRNAs regulados por KRAS em PDAC reprime os níveis de PTEN e promove características oncogênicas, indicando que esta assinatura deve ser avaliada como um novo biomarcador que pode ter implicações clínicas em PDAC.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is an extremely lethal disease, with a median survival of only 6 months and a 5-year overall survival of less than 7%. One possible reason for this lethality is that the most common oncogenic driver mechanism in PDAC, which is presnet in over 90% of patients, is the constitutive activation of the KRAS GTPase by oncogenic mutations; and even though KRAS is a rational therapeutic target, so far no efetive therapies for KRAS-induced malignancies have reached the clinical setting. Therefore, a better understanding of the oncogenic pathways triggered by KRAS is warranted and our projects goal was to identify KRAS molecular targets that promote the malignant phenotype. In that sense, we have investigated two KRASdependent oncogenic pathways that are poorly understood in PDAC: In Chapter 1, we have investigated the role of Aurora A (AURKA) kinase and its activator TPX2 as therapeutic targets in PDAC; and in Chapter 2, we performed functional analysis of KRAS-regulated microRNAs (miRNAs) in PDAC. In Chapter 1, RNAseq and qPCR analysis of PDAC patient samples showed that relative to matched adjacent non-tumor tissues, PDAC tumors display significantly higher expression of AURKA and TPX2. Next, using publicly available genomics PDAC datasets (TCGA and ICGC), we found that AURKA and TPX2 are co-expressed in PDAC, being high expression of AURKA and TPX2 associated with shorter patient survival and with the presence of oncogenic KRAS mutations. Moreover, targeting KRAS by RNA interference in KRAS-mutant PDAC cells led to reduced levels of AURKA and TPX2, thus confirming that AURKA and TPX2 are KRAS targets in PDAC. Finally, pharmacological inhibition of AURKA in KRAS-mutant PDAC cells led to decreased cell viability and proliferation, and AURKA or TPX2 targeting by RNA interference reduced their clonogenic and anchorage-independent growth, as well as reduced cell migration. These results support our hypothesis that AURKA and TPX2 are promising targets to be explored for KRAS-mutant PDAC therapy. In Chapter 2, we continued a previous study performed in the laboratory, where, using a microarray platform to compare microRNA expression between isogenic pancreatic epithelial cell lines, which differ only by expression of oncogenic KRAS, we identified 19 KRAS-upregulated microRNAs. First, using Ingenuity Pathways Analysis, we identified that the most regulated target of this KRAS-regulated microRNA network was the PTEN phosphatase, a protein with known tumor suppressor function, which had miRNA binding sites in the mRNA 3-UTR for 7 of these miRNAs. In accordance with this finding, KRAS silencing by RNA interference in PDAC cells increased PTEN protein levels and decreased expression of 3 of the 7 miRNAs that have PTEN as a predicted target. We also observed that pharmacological inhibition of PI3K/AKT or MAPK pathways, two KRAS effector pathways, did not change PTEN levels, suggesting that PTEN regulation by KRAS is independent of these pathways. More importantly, when miRNAs with KRAS-validated regulation were individually silenced by transfection with an inhibitory oligonucleotide, we observed, not only a similar increase in PTEN protein levels, but also a decrease in cell viability. Finally, combined inhibition of these 3 miRNAs induced cell death. In conclusion, we have identified a KRAS-regulated microRNA signature that targets the tumor suppressor PTEN and promotes oncogenicfeatures in PDAC cells, indicating that this signature should be tested as a new biomarker that could have clinical significance in PDAC.