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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2011.tde-25052011-145048
Documento
Autor
Nome completo
Fabio Kendi Tamaki
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2011
Orientador
Banca examinadora
Terra, Walter Ribeiro (Presidente)
Arantes, Guilherme Menegon
Araujo, Pedro Soares de
Guedes, Raul Narciso Carvalho
Silva Filho, Marcio de Castro
Título em português
Serina proteinases digestivas de insetos-modelo
Palavras-chave em português
Digestão
Digestão de proteínas
Insetos
Intestino medio
Quimotripsina
Tripsina
Resumo em português
Tripsinas e quimotripsinas, enzimas pertencentes à classe das serina proteinases, são as principais enzimas proteolíticas digestivas presentes no intestino médio de insetos de diversas ordens. Entretanto, enzimas de diferentes insetos possuem propriedades cinéticas distintas, sendo os motivos dessas diferenças especulados. Precipitações por sulfato de amônio das tripsinas de Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis e Spodoptera frugiperda mostram que insetos Lepidópteros possuem serina proteinases mais hidrofóbicas, que foi confirmado através de cromatografias de interação hidrofóbica e da análise de acesso do solvente às superfícies protéicas em modelagens tridimensionais de seqüências. Tal fato está relacionado à formação de oligômeros e resistência a defesas de plantas. Inativações por TPCK mostram que quimotripsinas digestivas de S. frugiperda, inseto polífago, reagem duas ordens de grandeza mais lentamente e possui um deslocamento do pH ótimo de modificação em mais de uma unidade quando comparada com dos outros dois organismos, fato relacionado à resistência a cetonas presentes em diversas plantas. A tripsina digestiva de Periplaneta americana foi purificada e microsseqüenciada, resultando na seqüência VSPAFSYGTG e associada a um alérgeno (denominado PaTry), expresso nos cecos e na região anterior do ventrículo. O anticorpo anti-tripsina de M. domestica reconheceu apenas uma banda no intestino de P. americana e foi utilizado para imunocitolocalizar tripsinas nos tecidos epiteliais, demonstrando que esta é secretada por exocitose nos cecos e na região anterior do ventrículo, como esperado. Por último, a atividade majoritária de quimotripsina se localiza surpreendentemente na região posterior do ventrículo de M. domestica. Apesar disso, apenas 28% dessa atividade é perdida através das fezes, pois 31% da atividade enzimática se encontra firmemente aderida à membrana, e 41% na fração celular solúvel (associada ao glicocálice), sendo a atividade solúvel luminal correspondente a apenas 12%, indicando a existência de pelo menos duas espécies moleculares distintas, uma solúvel e uma aderida à membrana, comprovado inativações térmicas das duas atividades (solúvel e aderida à membrana) na presença e na ausência de Triton X-100, sendo que a atividade aderida à membrana apresentou uma maior meia vida com uma cinética de primeira ordem nos dois casos. Ensaio em gel demonstrou que o homogeneizado possui apenas uma banda de atividade quimotríptica de 30 kDa. A atividade solúvel majoritária foi purificada até a homogeneidade, apresentando uma banda de 30 kDa em SDS-PAGE, pH ótimo de 7,4 e é 90% inativada por TPCK 0,1 mM em pH 8,5 em 15 min. Ela prefere substratos contendo Phe em P1, apesar clivar substratos contendo Tyr e Leu. Uma seqüência contígua similar a quimotripsina foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA de intestino médio de M. domestica, formada por 71 ESTs (de 826 seqüências obtidas ao acaso), indicando que esta deve corresponder à atividade majoritária. Essa seqüência, denominada MdChy1, prediz uma proteína madura de 28.639,2 Da e foi clonada e expressa de maneira recombinante em E. coli BL21 (DE-3) Star, sendo utilizada para produção de anticorpos policlonais em coelhos, que reconheceram uma banda de 30 kDa no ventrículo anterior e posterior, mas não no médio. Esses anticorpos foram utilizados para imunomarcações e reconheceram proteínas no lúmem, nas microvilosidades e em pequenas vesículas do epitélio, demonstrando que a quimotripsina é secretada ao lúmem por exocitose e indicando que o MdChy1 corresponde à atividade majoritária de quimotripsina. Análises de expressão em M. domestica indicam a existência de dois conjuntos de serina proteinases digestivas, um expresso na região anterior e um segundo na região posterior do ventrículo. O MdChy1 é expresso na região posterior, local em que se encontra a atividade majoritária de quimotripsina. Uma reconstrução filogenética dos genes similares a quimotripsinas de Drosophila melanogaster e de M. domestica demonstram que a MdChy1 se agrupa com genes expressos no intestino médio, portanto, com função digestiva.
Título em inglês
Digestive serine proteinases of model insects
Palavras-chave em inglês
Chymotrypsin
Digestion
Insect
Midgut
Protein digestion
Trypsin
Resumo em inglês
Trypsins and chymotrypsins, serine proteinases enzymes, are the major proteolytic activities present in the midgut of insects. However, enzymes obtained from different insects present different kinetic properties, and the reason for the differences are speculated. Trypsin precipitation of Tenebrio molitor, Diatraea saccharalis and Spodoptera frugiperda with ammonium sulfate showed that Lepidopteran insects possess serine proteinases with a higher superficial hydrophobicity than insects belonging to other orders, which may be associated to oligomerization of enzymes and resistance to inhibitors present in the food. This was confirmed by hydrophobic interaction chromatography and analysis of solvent access to serine proteinases surface. Moreover, inactivations of chymotrypsins by TPCK showed that S. frugiperda chymotrypsins react one order slower and has an optimum pH of modification more than 1 unit higher than chymotrypsins of D. saccharalis and T. molitor, which was related with the resistance of the enzyme to the presence of plant ketones, since S. frugiperda is a polyphagous organism. The digestive trypsin from Periplaneta americana midgut was purified microssequenced, resulting in the sequence VSPAFSYGTG, coincident to the MPA3 allergen (named PaTry), which is expressed in the caeca and anterior ventriculus. Western blot using M. domestica trypsin antisera recognized a single band, and immunohistochemical assays using this antisera showed that the P. americana trypsin is secreted by exocitosys in caeca and anterior ventriculus, which is coincident to the expression data. Although the major M. domestica chymotrypsin activity is present in the posterior ventriculus, only 28% of the activity is lost in feces, because 31% of activity is membrane-bound, and 41% is in the cellular soluble fraction (glycocalix-associated), and only 12% of total activity is soluble in the lumen, indicating the existence of at least two molecular species of chymotrypsins. Thermal inactivations of both activities (soluble and membrane-bound) showed that they may represent two different molecular enzymes, since the membrane-bound activity has a higher half-life than the soluble both in the presence and in the absence of Triton X-100. Both activities presented a linear first-order inactivation kinetic. In gel assays showed the presence of only one activity band in the midgut of 30 kDa. The major soluble activity was purified through one affinitychromatography, and active fractions presented a single 30 kDa band, a optimum pH of 7.4 and was 90% modified by TPCK 0.1 mM at pH 8.5 during 15 min. This enzyme preferentially cleaves substrates containing Phe residues in P1, although it cleaves substrates containing Tyr and Leu. A contig of a chymotrypsin-like sequence was randomly obtained from a cDNA library of M. domestica midguts from 71 ESTs (a total of 826 sequences), indicating that this sequence corresponds to the major activity present in the lumen. This sequence, named MdChy1, predicted a protein with 28639.2 Da which was cloned, recombinantly expressed in E. coli BL21 (DE-3) Star, this recombinant MdChy1 was used to raise polyclonal antibodies in rabbit. A western blot using this antisera recognised a single band in the anterior and posterior ventriculus, but not in the middle. Imunno-gold labeling of epithelium marked proteins in the lumen, at the microvilli and inside small vesicles, demonstrating that chymotrypsin is secreted through exocytosis in M. domestica and reinforcing that MdChy1 corresponds to the major chymotryptic activity found in the midgut. A semi-quantitative RT-PCR of M. domestica serine proteinase-like genes demonstrated that there are two set of genes, one expressed in the anterior and another in the posterior ventriculus, as visualized in western blot. MdChy1 is expressed in the posterior ventriculus, where the major chymotryptic activity is found. A phylogenetic reconstruction of Drosophila melanogaster chymotrypsin-like sequences and M. domestica chymotrypsins showed that MdChy1 branched with sequences expressed in midgut, thus coding proteins involved in digestion.
 
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Data de Publicação
2011-06-28
 
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