Vírus que utilizam bactérias como hospedeiros para sua propagação são denominados bacteriófagos ou fagos. A partícula viral (vírion) contém uma cópia do genoma do fago envolto por uma capa proteica ou lipídica e proteica de morfologia variada. Os fagos se propagam através do ciclo de vida lítico ou lisogênico. No ciclo lítico, após interação do vírion com moléculas receptoras da superfície bacteriana, o fago injeta o material genético na célula, novas partículas virais são produzidas e liberadas para o ambiente pela lise da célula bacteriana. Além da atividade bactericida propriamente dita, os fagos possuem enzimas, genericamente denominadas de despolimerases, que degradam polissacarídeos bacterianos e poderiam ser utilizadas como antibacterianos. Nos últimos anos, o interesse no uso de fagos como agente terapêutico (fagoterapia) foi retomado como estratégia para o controle biológico de bactérias multidrogarresistentes. Em trabalho anterior foram isolados fagos de amostras de compostagem utilizando-se o patógeno oportunista Pseudomonas aeruginosa (cepa PA14) como bactéria hospedeira. O fago ZC01 foi classificado no grupo denominado Siphoviridae YuA-like (família Siphoviridae) e o fago ZC03 pertence a um novo clado no grupo denominado Podoviridae N4-like (família Podoviridae). ZC01 e ZC03 são líticos para PA14 e se mostraram capazes de dissolver o biofilme dessa cepa. Neste trabalho tivemos como objetivos aprofundar a caracterização dos fagos ZC01 e ZC03 e avaliar seu potencial para fagoterapia na infecção por P. aeruginosa em modelo de Galleria mellonella. Determinamos que o fago ZC01 tem um período de latência de 100 minutos e produz ~87 partículas virais por célula infectada (burst size) aos 120 minutos do início da infecção, diferentemente do relatado para o fago ZC03 que possui um período latente de 50 minutos e burst size de aproximadamente 10 fagos. Nossos resultados mostraram que os fagos ZC01 e ZC03 são mais estáveis em temperaturas e pHs compatíveis com os fisiológicos (25°C e 37°C, pH 7,5) sendo que apresentam importante redução da viabilidade em pHs ácidos e alcalinos ou temperaturas acima de 60°C. Através de análises de proteômica, estimamos que os vírions de ZC01 e ZC03 sejam constituídos por, no mínimo, 27 e 40 proteínas, respectivamente, as quais incluem, além de proteínas estruturais típicas, como proteínas do capsídeo, cauda e de fibras da cauda, enzimas relacionadas a interação do fago e seu hospedeiro e proteínas com função ainda desconhecida. Apresentamos evidência empírica de que o fago ZC01 apresenta atividade de despolimerase possivelmente codificada por um domínio da ORF ZC01_066, anotada como proteína da fibra da cauda. Além disso, confirmamos que estes dois fagos têm uma abrangência restrita e relativamente distinta de isolados clínicos de P. aeruginosa. Finalmente, resultados iniciais mostraram que os fagos ZC01 e ZC03 são capazes de combater, ainda que parcialmente, a infecção por PA14 em larvas de G. mellonella. O desenvolvimento desse trabalho possibilitou o estabelecimento de protocolos de propagação e obtenção de vírions adequados para sua caracterização através de técnicas analíticas, tais como proteômica e microscopia eletrônica, e avaliação de seu potencial para fagoterapia.

Viruses that use bacteria as hosts for replication are called bacteriophages or phages. A viral particle (virion) contains a copy of the genome packaged within a capsid of varied morphology that is composed of proteins or lipids and proteins. Phages propagate through lytic or lysogenic life cycles. In the lytic cycle, after interaction with receptor molecules on the bacterial surface, the phage injects its genetic material into the cell, new viral particles are produced and released into the environment after bacterial cell lysis. In addition to the bactericidal activity itself, the phages produce enzymes, generally called as depolymerases. These enzymes degrade polysaccharides and have been suggested as antibacterials. Recently, the use of phages as therapeutic agents (phage therapy) has been renewed as a strategy for biological control of multidrug-resistant bacteria. In a previous work, phages were isolated from composting samples using as host bacterium the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa (strain PA14). The phage ZC01 was classified in the Siphoviridae YuA-like group (family Siphoviridae) and the phage ZC03 belongs to a new clade in the Podoviridae N4-like group (family Podoviridae). ZC01 and ZC03 are lytic for PA14 and have been shown to dissolve the biofilm of this strain. In this work we aimed to expand the characterization of phages ZC01 and ZC03 and to evaluate their potential for phage therapy in P. aeruginosa infection using Galleria mellonella as animal model. We determined that phage ZC01 has a latency period of 100 minutes and produces ~87 viral particles per infected cell (burst size) upon 120 minutes after infection. On the other hand, it has been reported that phage ZC03 has a latent period of 50 minutes and burst size of approximately 10 phages. Our results showed that the phages ZC01 and ZC03 are more stable at temperatures and pHs compatible with physiological values (25°C and 37°C, pH 7.5), showing reduction in their viabilities upon exposure at acidic and alkaline pHs or temperatures above 60°C. Using proteomics, we estimated that the virions of ZC01 and ZC03 are composed of at least 27 and 40 proteins, respectively, which include, besides the typical structural proteins, such as capsid, tail and tail fiber proteins, enzymes related to the host-phage interaction as well as proteins with yet unknown function. We present empirical evidence that phage ZC01 has depolymerase activity possibly encoded by a domain in the ORF ZC01_066 which is annotated as a tail fiber protein. In addition, we confirm that these two phages have a restricted and relatively distinct host range of P. aeruginosa clinical isolates. Lastly, our initial results showed that phages ZC01 and ZC03 are capable of protect, even partially, the PA14 infection in G. mellonella larvae. The development of this work allowed us to establish protocols to obtain phage preparation adequate for characterization through analytical techniques, such as proteomics and electron microscopy, and for evaluation of phage therapy potential.