• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Dissertação de Mestrado
DOI
10.11606/D.46.2013.tde-22102013-112950
Documento
Autor
Nome completo
Rosangela Aparecida Wailemann Mansano
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Labriola, Leticia (Presidente)
Abdulkader, Fernando Rodrigues de Moraes
Camargo, Anamaria Aranha
Título em português
Estudo do papel da proteína HSP27/25 na ação da prolactina humana recombinante em células beta pancreáticas
Palavras-chave em português
Apoptose
Células beta pancreáticas
Diabetes mellitus
HSP27/25
Prolactina
Resumo em português
Um dos objetivos no tratamento de Diabetes mellitus é aumentar a função, proliferação e sobrevivência de células beta pancreáticas, pois o transplante de ilhotas pancreáticas é severamente limitado pela escassez de doadores de órgãos. Nós mostramos que prolactina recombinante humana (rhPRL) apresenta efeitos benéficos em células beta, inibindo a apoptose. Recentemente reportamos o aumento dos níveis de expressão da proteína antiapoptótica HSP27/25, regulada por rhPRL em ilhotas humanas. Nosso objetivo é explorar o papel de HSP27/25 na citoproteção induzida por prolactina em células beta. Métodos: Células MIN6 parentais e silenciadas para HSP25 foram privadas de soro por 24h e cultivadas na presença ou ausência de rhPRL (300ng/mL). Posteriormente foram tratadas na presença ou ausência de uma combinação de citocinas (TNF-α, INF-γ e IL-1β) por diferentes períodos de tempo. A apoptose foi avaliada usando-se análise por citometria de fluxo. Os níveis de expressão gênica de HSP27/25 e membros da família BCL-2, da expressão proteica de membros desta mesma família, além de Caspase-9, Smac-Diablo HSP27/25, HSTF1, pP38 e pSTAT1 foram analisados por Westen blot. Ainda, foram avaliadas a atividade de Caspase-8 e -3, por ensaios fluorimétricos. Após o tratamento com rhPRL e citocinas, a proporção de núcleos fragmentados aumentou em células silenciadas para HSP25 (p<0,05), quando comparadas com células controles. A inibição da atividade de Caspase-3 e -8, tanto quanto os níveis de expressão proteica de caspase- 9, por rhPRL e o aumento da razão de expressão Bcl-2/Bax e BclxL/Bax foram revertidos em células silenciadas (p<0,05). Além disso, a cinética dos níveis de expressão de HSP27/25 e HSTF1 foram estudadas em culturas de ilhotas pancreáticas humanas, mostrando que enquanto HSTF1 apresenta um aumento significativo (p<0,01) nos níveis de expressão proteica após 10min de tratamento com rhPRL, HSP27 alcançou seu nível máximo após 2h do tratamento hormonal. Adicionalmente, foi detectado um aumento significante (p<0,05) nos níveis de fosforilação de STAT1 e de p38, após 10min, atingindo o pico de expressão após 30min (p<0,01) do tratamento com rhPRL. Estes estudos demonstram o papel chave de HSP27/25 sobre os efeitos citoprotetores induzidos por rhPRL, desde que a ausência desta proteína aboliu completamente os efeitos benéficos induzidos por PRL sobre a morte de células beta. Ainda, nós fornecemos pela primeira vez, evidências da corregulação de HSP27 e HSTF1 induzidas por rhPRL em células humanas pancreáticas, que pode estar sendo mediada pela ativação de STAT1 e p38. Coletivamente, nossos resultados podem conduzir para a atenuação da morte de células beta por meio da regulação de uma via de proteção endógena, a qual é independente da modulação do sistema imunológico.
Título em inglês
Role of HSP27/25 in PRL-induced cytoprotective effects on beta cells.
Palavras-chave em inglês
Apoptosis
Beta-cell
Diabetes mellitus
HSP27/25
Prolactin
Resumo em inglês
One of the goals in Diabetes mellitus treatment is to enhance pancreatic β-cell function, proliferation and survival since transplantation of pancreatic islets is severely limited by shortage of organ donors. We have shown that recombinant human prolactin (rhPRL) inhibits beta-cell apoptosis. We have recently reported PRL-induced up-regulation of the anti-apoptotic HSP25/27 in human islets. Since the function of HSP25/27 in beta-cells has not been directly studied, we set out to explore the role of HSP25/27 in prolactin-induced beta-cell cytoprotection. Methods: Parental and HSP25 knocked-down Min6 cells were serumstarved for 24h and then cultured in the presence or in the absence of rhPRL (300ng/mL) for different time periods. Apoptosis was evaluated using flow cytometry analysis. Levels of Bcl-2 gene family members, caspase-9, Bcl-2, BclxL, Bax, Smac-Diablo, HSP27/25, HSTF1, pStat- 1,pP38 were studied by western blot. Caspase-3 and -8 activity, were evaluated by fluorimetric assays. Upon cytokines and rhPRL treatment, the proportion of fragmented nuclei was increased in HSP25 silenced cells (p<0.05) when compared to control cells. The inhibition of cytokine-induced capase-3 and -8 activity as well as Bcl-2/Bax and BclxL/Bax ratios and caspase-9 protein levels mediated by rhPRL in wild type cells was reverted in knocked-down cells (p<0.05). Moreover, the kinetics of HSP 25/27 and HSTF1 expression levels studied in primary cultures of human pancreatic islets showed that while HSTF1 presented a significant increase (p<0.01) in protein expression level after 10 min of rhPRL treatment, HSP27 reached its maximum expression level upon 2h of hormonal treatment. Additionally, a significant (p<0.05) increase in both P38 and STAT1 phosphorylation levels were detected after 10min of rhPRL treatment reaching the highest levels upon 30 min (p<0.001) of hormonal treatment. Therefore, we demonstrated a key role for HSP25/27 in rhPRL-induced cytoprotective effects, since the lack of this protein completely abolished the beneficial effects induced by PRL on beta-cell death. Moreover, we provided for the first time, evidence for the co-regulation of HSP27 and HSTF1 induced by rhPRL in human pancreatic cells which could be mediated by activated STAT1 and P38. Collectively, our results could lead to the mitigation of beta-cell death through the up-regulation of an endogenous protective pathway which is independent on the modulation of the immune system.
 
AVISO - A consulta a este documento fica condicionada na aceitação das seguintes condições de uso:
Este trabalho é somente para uso privado de atividades de pesquisa e ensino. Não é autorizada sua reprodução para quaisquer fins lucrativos. Esta reserva de direitos abrange a todos os dados do documento bem como seu conteúdo. Na utilização ou citação de partes do documento é obrigatório mencionar nome da pessoa autora do trabalho.
Data de Publicação
2013-11-13
 
AVISO: Saiba o que são os trabalhos decorrentes clicando aqui.
Todos os direitos da tese/dissertação são de seus autores
Centro de Informática de São Carlos
Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP. Copyright © 2001-2019. Todos os direitos reservados.