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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.2013.tde-21052013-134648
Documento
Autor
Nome completo
Cecília Midori Ikegami
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2013
Orientador
Banca examinadora
Marana, Sandro Roberto (Presidente)
Carvalho, Cristiane Rodrigues Guzzo
Gueiros Filho, Frederico José
Salinas, Roberto Kopke
Tersariol, Ivarne Luis dos Santos
Título em português
Caracterização funcional dos resíduos centrais da rede estrutural da β-glicosidase Sfβgli de Spodoptera frugiperda
Palavras-chave em português
Aminoácidos centrais
Atividade enzimática
Beta-glicosidase
Enzima mutante
Enzimologia
Inativação térmica
Rede
Resumo em português
Na última década, a análise da estrutura proteica baseada em teoria de redes/grafos tem emergido. A abstração da estrutura tridimensional proteica em forma de uma rede, leva em consideração os resíduos de aminoácidos e suas interações através do espaço, e apresenta um conjunto de conexões e propriedades mais complexas do que aquelas visualizadas apenas com a estrutura covalente. A análise da estrutura proteica identificou que as proteínas pertencem às redes de classes de "mundo pequeno" (small-world) e "sem escala" (scale-free), o que significa que seus resíduos de aminoácidos são altamente agregados e que existem poucas conexões entre 2 resíduos quaisquer da proteína. A identificação dos resíduos com alto grau de conexão, chamados centrais ("resíduos hubs"), é feita pela determinação do caminho mais curto que conecta um dado resíduo aos demais compreendidos nesta rede. A remoção destes resíduos centrais (hubs) afeta a integridade da rede de forma mais contundente diferentemente da remoção de resíduos que não são centrais. Até o momento estes "resíduos hubs" ainda não foram experimentalmente correlacionados com as propriedades enzimáticas de proteínas. Para tal finalidade, a estrutura terciária de uma β-glicosidase de Spodoptera frugiperda (Sfβgli) foi analisada como uma rede. Após calcular-se os caminhos médios entre todos os pares de aminoácidos da β-glicosidase, encontrou-se 11 resíduos centrais ("resíduos hubs"). Alinhamento de sequências e comparações estruturais indicaram alta conservação destes "resíduos hubs". Nosso objetivo foi produzir esta β-glicosidase mutando-se a maioria dos "resíduos hubs" e 3 aminoácidos não centrais ("não hubs"), expressar estes mutantes em E. coli, determinar suas propriedades enzimáticas como atividade catalítica e preferência pelo substrato e verificar a estabilidade destes mutantes em experimentos de inativação térmica. Os resultados obtidos sugerem que mutações nos "resíduos hubs" não afetam as propriedades catalíticas, contudo as enzimas com mutações nos "resíduos hubs" apresentaram uma menor estabilidade térmica. Estes resultados sugeriram que os "resíduos hubs" são relevantes na difusão da energia cinética (vibração) introduzida na estrutura desta β-glicosidase pelo seu aquecimento
Título em inglês
Functional characterization of the central residues of the structural network of β-glucosidase Sfβgly from Spodoptera frugiperda
Palavras-chave em inglês
Beta-glucosidase
Enzyme activity
Enzymology
Hubs
Mutation
Network
Thermal inactivation
Resumo em inglês
In recent years, graph-theoretic approaches have established that protein structures can be modeled as complex networks of interacting residues. Proteins structures can be represented as small-world and scale-free networks that are usually highly clustered with few links connecting any pair of nodes. The identification of nodes with high connection degrees, called hubs, is made by determining the shortest path linking one amino acid to the further nodes comprising the network. Targeted removal of the hubs has greater affect on the integrity of the network structure in contrast to a random removal of amino acid residues comprising the network. Nevertheless these hubs had not previously been correlated with enzymatic properties. The tertiary structure of β-glycosidase from S. furgiperda (Sfβgly) was analyzed as a network. After calculating the averaged paths between all pairs of amino acid residues of Sfgly, we defined 11 hubs, which have the highest centrality on the network. Sequence alignment and structural comparison showed that these hubs residue are conserved among β-glycosidases. Our goal was to mutate most hubs and 3 ´non-hubs´ residues from Sfβgly, express these mutant enzymes in E. coli, test their enzymatic properties as catalytic efficiency and substrate preference, and verify the thermal stability of these mutants. The results implied that mutations in these hubs do not cause changes in catalytic properties although enzymes containing mutations in hubs showed lower thermal stability. Based on that, it was suggested that hub residues are important in the diffusion of kinetic energy (vibrations) introduced in the Sfβgly structure by heating
 
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Data de Publicação
2013-07-05
 
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