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Doctoral Thesis
DOI
10.11606/T.46.2016.tde-18052016-154959
Document
Author
Full name
Carlos William Francischini
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2009
Supervisor
Committee
Quaggio, Ronaldo Bento (President)
Alegria, Marcos Castanheira
Colepicolo Neto, Pio
Oliveira, Carla Columbano de
Silva Filho, Marcio de Castro
Title in Portuguese
Identificação e caracterização de RNA mensageiros candidatos a alvo das proteínas PUMILHO de Arabidopsis através do sistema triplo-híbrido de levedura
Keywords in Portuguese
Arabidopsis Thaliana
Bioquímica vegetal
Controle traducional
Desenvolvimento vegetal
Proteínas de ligação a RNA
Proteínas PUF
RNA Mensageiro (Identificação;Análise)
Sistema triplo-híbrido
Abstract in Portuguese
Proteínas PUF regulam a estabilidade e a tradução através da ligação a seqüências específicas nas regiões 3' não traduzidas (3' UTR) dos mensageiros. A ligação é mediada por um domínio de ligação conservado constituído por 8 repetições de aproximadamente 36 aminoácidos cada. Experimentos realizados no sistema triplo-híbrido de levedura mostraram que os homólogos PUF de Arabidopsis APUM-1, APUM-2 e APUM-3 são capazes de ligar especificamente à seqüência chamada de Elemento de Resposta a NANOS (NRE) reconhecida pelo homólogo PUF de Drosophila. A utilização de bibliotecas de expressão de RNA em ensaios no sistema triplo-híbrido permitiu a identificação de seqüências de ligação consenso para as três proteínas APUM. Análises computacionais identificaram elementos de ligação a APUM em regiões 3' UTR de importantes transcritos relacionados ao controle do meristema do caule e à manutenção das células totipotentes. Nós mostramos que os homólogos APUM-l, APUM-2 e APUM-3 reconhecem elementos de ligação a APUM nas regiões 3' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-2. Ensaios de RT-PCR e Western blot semiquantitativos mostraram que a quantidade dos transcritos WUSHEL e CLAVATA-1 é alterada em plantas antisenso induzíveis para APUM-l, APUM-2 e APUM-3. A relevância biológica dessas interações foi observada através de ensaios de coimunoprecipitação, confirmando, portanto, o primeiro caso de regulação traducional descrito para os mensageiros WUSCHEL e CLAVATA-1. Análises computacionais adicionais para a identificação de outros homólogos PUF em Arabidopsis encontraram vinte e cinco proteínas possuindo repetições PUF. Entre elas, os homólogos APUM-4, APUM-S e APUM-6 apresentam alta similaridade com as proteínas APUM-l, APUM-2 e APUM-3, sendo capazes de ligar especificamente à seqüência NRE e aos elementos de ligação a APUM presentes nas regiões 3' UTR dos transcritos WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE e FASCIATA-ts resultados indicam que vários homólogos PUF podem agir como reguladores traducionais em Arabidopsis através de um mecanismo molecular conservado entre as espécies, podendo abrir uma nova área de investigação da regulação de mRNA em plantas.
Title in English
Identification and characterization of mRNA targets candidates of the Arabidopsis PUMILIO (APUM) proteins using the yeast three-hybrid systern
Keywords in English
Arabidopsis thaliana,Translational control
Bioquímica vegetal
Desenvolvimento vegetal
PUF proteins
RNA mensageiro (Identificação; Análise)
RNA-binding protein
Three-hybrid system
Abstract in English
PUF proteins regulate stability and translation through sequence-specific binding to 3' untranslated regions (UTR) oftarget mRNA transcripts. Binding is mediated by a conserved PUF domain which contains 8 repeats of approximately 36 amino acids each. Through three-hybrid assays, we have found that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 Arabidopsis PUF homologs can bind specifically to the NANOS Response Element sequence (NRE) recognized by Drosophila PUF homologo Using Arabidopsis RNA libraries in three-hybrid screenings, we were able to identify APUM binding consensus sequences. A computational analysis allowed us to identify the APUM binding element within the 3' UTR in many Arabidopsis transcripts, even in important mRNAs related to shoot and stem cell maintenance. We show that APUM-1, APUM-2 and APUM-3 are able to bind specifically to APUM binding elements in the 3' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. RT-PCR and Western blot semiquantitatives assays showed altered WUSHEL and CLAVATA-1 amounts in APUM-1, APUM-2 and APUM-3 antisense plants. The biologic relevance of these interactions was observed with co-immunoprecipitation assay, which confirmed the first example of translational regulation to WUSCHEL and CLA VATA-1 transcripts. Computational analysis to identify others PUF homologs in Arabidopsis found twenty five proteins presenting PUF repeats. Among them, we found that APUM-4, APUM-S and APUM-6 homologs are very similar to APUM-1, APUM2 and APUM-3 and also are able to bind specifically to the NRE sequence and to APUM binding elements in the 3' UTR of WUSCHEL, CLAVATA-1, ZWILLE and FASCIATA-2 transcripts. Our results indicate that the APUM proteins may act as regulators in Arabidopsis through an evolutionarily conserved mechanism, which may open up a new approach to investigate mRNA regulation in plants.
 
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Publishing Date
2016-05-18
 
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