• JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
  • JoomlaWorks Simple Image Rotator
 
  Bookmark and Share
 
 
Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.46.2021.tde-17012022-173219
Document
Auteur
Nom complet
Ronaldo Bertolucci Junior
Adresse Mail
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2021
Directeur
Jury
Baldini, Regina Lúcia (Président)
Bisson Filho, Alexandre Wilson
Gueiros Filho, Frederico José
Marques, Marilis do Valle
Titre en portugais
Expressão e localização celular da diguanilato ciclase DgcP em Pseudomonas aeruginosa
Mots-clés en portugais
c-di-GMP
Fatores de virulência
Pilus tipo IV
Pseudomonas aeruginosa
Resumé en portugais
A bactéria Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista frequentemente associado a vítimas de queimaduras graves ou indivíduos com fibrose cística, sendo os isolados resistentes a carbepenêmicos dessa espécie considerados pela OMS como uma das maiores ameaças ao controle de infecções. O estabelecimento da infecção por esse patógeno é dependente de uma série de fatores de virulência, entre eles o pilus tipo IV (T4P), que possui papel importante na adesão a superfícies e motilidade do tipo twitching, essenciais para a colonização do hospedeiro. Uma das moléculas importantes na diferenciação entre as formas séssil e planctônica de P. aeruginosa é o segundo mensageiro bis-(3,5)-di-guanosina monofosfato cíclico (c-di-GMP), cuja síntese é feita enzimaticamente por diguanilato ciclases (DGCs). DgcP é uma DGC localizada nos polos da célula, que tem sua atividade de síntese de c-di-GMP aumentada na presença da proteína FimV, essencial para a montagem do T4P em P. aeruginosa. Neste trabalho, ensaios de microscopia de fluorescência, organização e expressão gênica foram realizados com o objetivo de aumentar a compreensão sobre o papel de DgcP em relação a sua expressão e aos fatores que regulam o T4P de P. aeruginosa. A proteína DgcP em fusão com mNeonGreen no C-terminal, expressa a partir do locus cromossômico, se localiza de maneira predominantemente bipolar tanto na linhagem selvagem quanto nos mutantes ΔpilA, ΔpilR e ΔchpA, evidenciando que seu padrão de localização não depende dos sistemas de regulação Pil-Chp e PilS-PilR. Ensaios de RT-PCRmostraram que dgcP se encontra em operon com PA14_72430 e dsbA1, indicando um papel celular conjunto entre esses genes, até o momento, desconhecido. Por fim, ensaios de qRT-PCR revelaram que os níveis de mRNA de dgcP são invariáveis nas linhagens WT, ΔpilA, ΔpilR, ΔchpA e ΔfimV, cultivadas em meio líquido ou meio sólido. Os resultados aqui mostrados, combinados com trabalhos prévios do nosso e de outros grupos, sugerem que DgcP é uma diguanilato ciclase responsável por geração constante de c-di-GMP nos polos da célula, possivelmente, atuando na sinalização local dependente do dinucleotídeo cíclico, cuja localização e atividade não são dependentes dos sistemas de regulação que atuam sobre o T4P.
Titre en anglais
Expression and cell localization of the diguanylate cyclase DgcP in Pseudomonas aeruginosa
Mots-clés en anglais
c-di-GMP
Pseudomonas aeruginosa
Type IV pilus
Virulence factors
Resumé en anglais
The Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen often associated with severe burn victims or individuals with cystic fibrosis, which carbapenem-resistant isolates were classified by th World Health Organization classified one of the greatest threats to infection control. The establishment of infection by this pathogen is dependent on a series of virulence factors, including the type IV pilus (T4P), which plays an important role in adhesion to surfaces and twitching motility, essential features for host colonization. Bis-(3',5')-cyclic dimeric guanosine monophosphate (c-di-GMP) is a second messenger that involved in processes of biofilm formation, motility, and virulence. The diguanylate cyclase DgcP synthetizes cdi-GMP and it is located at the cell poles, and its activity depends on the scaffold protein FimV, essential for T4P assembly in P. aeruginosa. By increasing c-di-GMP levels, DgcP decreases flagellum-dependent motility and increases biofilm formation. In this work, fluorescence microscopy, gene organization and expression assays were performed to understand the whether DgcP localization and expression are under the control of T4P regulatory proteins. Fluorescence microscopy analysis showed that DgcP localizes predominantly at both cell poles in ΔpilA, ΔpilR, and ΔchpA mutants, showing that its localization pattern does not depend on the Pil-Chp and PilS-PilR systems. Furthermore, RT-PCR assays showed that dgcP is found in an operon with PA14_72430 and dsbA1, indicating an unknown putative related cellular role for these genes. Finally, qRT-PCR assays indicated that DgcP expression is invariant in ΔpilA, ΔpilR, ΔchpA, and ΔfimV mutants, either in liquid or solid medium. The results shownhere, combined with previous work by ours and other groups, suggest that DgcP is a diguanylate cyclase responsible for constant generation of c-di-GMP at the cell poles, possibly acting in local signaling dependent on the cyclic dinucleotide, but that is not under the control of the known T4P regulatory systems.
 
AVERTISSEMENT - Regarde ce document est soumise à votre acceptation des conditions d'utilisation suivantes:
Ce document est uniquement à des fins privées pour la recherche et l'enseignement. Reproduction à des fins commerciales est interdite. Cette droits couvrent l'ensemble des données sur ce document ainsi que son contenu. Toute utilisation ou de copie de ce document, en totalité ou en partie, doit inclure le nom de l'auteur.
Date de Publication
2022-05-10
 
AVERTISSEMENT: Apprenez ce que sont des œvres dérivées cliquant ici.
Tous droits de la thèse/dissertation appartiennent aux auteurs
CeTI-SC/STI
Bibliothèque Numérique de Thèses et Mémoires de l'USP. Copyright © 2001-2024. Tous droits réservés.