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Disertación de Maestría
DOI
https://doi.org/10.11606/D.46.2021.tde-17012022-172119
Documento
Autor
Nombre completo
Rebeca Bueno Alves
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2021
Director
Tribunal
Souza-Pinto, Nadja Cristhina de (Presidente)
Chammas, Roger
Hoch, Nicolas Carlos
Meira, Lisiane Borges
Título en portugués
Investigação do papel de Alquiladenina DNA glicosilase (AAG) no reparo de bases alquiladas no DNA mitocondrial de camundongos
Palabras clave en portugués
AAG
Alquilação
BER
Mitocôndria
Reparo de DNA
Resumen en portugués
Os organismos vivos estão constantemente expostos a agentes que podem danificar seu DNA. A existência de mecanismos de reparo de DNA contribui para a manutenção da integridade do genoma. O DNA mitocondrial (mtDNA) acumula mais lesões que o nuclear, em parte devido a sua localização próxima a cadeia de transporte de elétrons, geradora de espécies reativas de oxigênio, e ao fato de a organela acumular cátions lipofílicos que podem reagir com o DNA. Nessas organelas, a principal via de reparo é o reparo por excisão de base (BER, do inglês base excision repair) que repara quebras de simples fita e pequenas modificações de bases como oxidações e alquilações. BER é iniciado pelo reconhecimento das bases modificadas por uma DNA glicosilase. Bases alquiladas, como a 3-metiladenina, uma lesão tóxica para a célula, são removidas pela alquiladenina DNA glicosilase (AAG). Alterações em vias de reparo de DNA contribuem para doenças humanas e respostas terapêuticas. Por exemplo, a atividade de AAG pode modular a eficiência de vários quimioterápicos em uso clínico. Nesse contexto, modelos murinos são amplamente utilizados em estudos mecanísticos e clínicos. Atualmente, sabe-se que AAG se localiza na mitocôndria e no núcleo humanos, porém, sua localização na mitocôndria frente a exposição a agentes alquilantes ainda não foi detectada em camundongos. Assim, o presente trabalho buscou investigar o papel de AAG no reparo de DNA mitocondrial em células de camundongos (C2C12) tratadas com o agente alquilante metilmetanosulfonato (MMS). As taxas de formação e reparo de lesões induzidas por MMS foram medidas utilizando PCR de longa extensão (XLPCR), que se baseia na diminuição da amplificação pela presença de lesões no DNA que impedem a progressão da DNA polimerase. Os resultados obtidos com XL-PCR mostram que o tratamento com MMS causa formação de lesões no mtDNA de camundongos, que são completamente removidas após 24h, como observado no núcleo. A medida do número de cópias demonstrou que não há perda de mtDNA após o tratamento, sugerindo que as lesões induzidas estão sendo removidas por reparo, e não por degradação do DNA afetado. Para identificar se é AAG a enzima responsável pela remoção dessas lesões foi realizada colocalização por imunofluorescência. Os resultados demonstram presença citoplasmática de AAG, sugerindo uma possível localização mitocondrial de AAG nesses organismos
Título en inglés
Investigation of the role of alkyladenine DNA glycosylase (AAG) in the repair of alkylated bases in mice mitochondrial DNA
Palabras clave en inglés
AAG
Alkylation Damage
BER
DNA Repair
Mitochondria
Resumen en inglés
Living organisms are constantly exposed to agents that can damage their DNA. DNA repair mechanisms contribute to maintain genomic stability. The mitochondrial DNA (mtDNA) is also subject to damage and may accumulate more lesions than nuclear DNA, likely due to its location, close to the reactive oxygen species-generating electron transport chain. In mitochondria, the main DNA repair pathway is the base excision repair (BER), which repairs single strand breaks and base modifications such as oxidations and alkylations. BER is initiated by the recognition of modified bases by a DNA glycosylase. Alkylated bases, like 3- methyladenine, a cytotoxic DNA lesion, are recognized and repaired by the alkyladenine DNA glycosylase (AAG). Changes in DNA repair are implicated in human diseases and impact therapeutic efficiency. For instance, AAG activity can modulate the efficiency of various chemotherapeutic agents. These studies are usually conducted in murine models. AAG has been localized to mitochondria and nuclei in human cells, but mitochondrial localization in murine mitochondria after alkylation damage has not yet been detected. Thus, in the present work we sought to investigate the role of AAG in mtDNA repair in mouse cells (C2C12) treated with the alkylating agent methylmethanesulfonate (MMS). MMS-induced lesion formation and repair were measured using long-range PCR (XL-PCR), which is based on the principle that lesions that block the DNA polymerase progression will affect the amplification of a long DNA fragment. The results obtained showed that MMS induces lesion formation in mouse mtDNA, which are completely removed after 24 hours, as observed in the nucleus. There is no mtDNA depletion, as measured by mtDNA copy number, suggesting that MMS-induced lesions are being removed by DNA repair, rather than by degradation of the affected DNA. To ascertain whether AAG is the enzyme responsible for removing these lesions, AAG intracellular localization was evaluated by immunofluorescence. Results showing cytosolic AAG localization suggest a possible mitochondrial localization of AAG in these organisms.
 
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Fecha de Publicación
2022-05-10
 
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