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Tese de Doutorado
DOI
10.11606/T.46.1982.tde-15082013-101006
Documento
Autor
Nome completo
Clelia Ferreira Terra
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 1982
Orientador
Título em português
Aspectos ultraestruturais e enzimáticos do processo digestivo e caracterização física e cinética da celobiase intestinal de rhynchosciara americana
Palavras-chave em português
Bioquímica
Digestão animal
Diptera
Insetos
Intestino de animal
Resumo em português
Os cecos gástricos de Rhynchosciara americana e de outros insetos são órgãos envolvidos em digestão terminal e/ou absorção de nutrientes. Devido a isso, a sua disposição na região anterior do ventrículo é intrigante. Uma explicação para essa localização seria a existência de uma circulação endo-ectoperitrófica de fluidos e de enzimas digestivas, como foi proposto anteriormente em R. americana. Afim de procurar reforçar o modelo proposto procurou-se obter dados sobre a ultraestrutura das células do tubo digestivo e sobre a composição enzimática de suas microvilosidades. As células dos cecos e do ventrículo posterior distal tem uma ultraestrutura bastante semelhante; elas possuem grandes microvilosidades apicais e a membrana plasmática basal apresenta invaginações com mitocôndrias associadas, embora a maioria dessas organelas sejam encontradas no citoplasma apical. O compartimento extracelular delimitado por essas invaginações da membrana basal apresenta poucas aberturas para a hemolinfa, o que dá à célula a possibilidade de concentrar solutos nesse compartimento. As células do ventrículo anterior possuem microvilosidades apicais muito pequenas e um sistema elaborado de invaginações da membrana basal, com muitas mitocôndrias associadas, e que se estendem até quase o ápice das células. O compartimento extracelular delimita do por essas invaginações apresenta, nessas células, grande número de aberturas para a hemolinfa. O ventrículo posterior proximal representa uma região de transição entre o ventrículo anterior e o ventrículo posterior distal. A ultraestrutura dos cecos e ventrículo posterior distal é coerente com uma função na absorção de fluidos, enquanto que aquela do ventrículo anterior e coerente com uma função de secreção de fluidos. A análise da composição de enzimas nas microvilosidades das diferentes regiões do intestino médio mostrou novamente que as células dos cecos e do ventrículo posterior distal são semelhantes e também que devem estar envolvidas na digestão terminal dos nutrientes, pois possuem alta atividade específica para hidrolases de oligômeros. As células do ventrículo anterior (e do ventrículo posterior proximal) possuem microvilosidades com atividade específica muito baixa para as hidrolases de oligômeros, corno seria de esperar para urna célula que estivesse secretando fluidos, pois o substrato seria continuamente arrastado para longe da enzima. Os dados obtidos permitiram reforçar e refinar o modelo da circulação endo-ectoperitrófica de enzimas em R.americana. Para melhor compreensão da digestão terminal de proteínas em R.americana, aminopeptidases de diferentes regiões do tubo digestivo foram estudadas. As aminopeptidases do lúmen e do citossol das células dos cecos são semelhantes, e ambas diferem daquelas presentes na membrana plasmática dessas células. Os dados obtidos apoiam a hipótese de que a maioria das aminopeptidases solúveis nas células dos cecos são enzimas em via de serem secretadas para o lúmen e somente urna quantidade muito pequena pode ter urna função intracelular. Para iniciar o estudo das propriedades das enzimas envolvidas na digestão terminal, a celobiase ligada a membrana plasmática dos cecos foi escolhida. A celobiase solubilizada por Triton X-100 apresenta um peso molecular de 106.000 e um pI de 5,4, enquanto que a solubilização por papaína resulta em urna molécula com peso molecular de 65.000 e um pI de 4,7. A celobiase solubilizada por papaína e purificada por centrifugação em gradientes de densidade hidrolisa β-glicosídeos, β-galactosídeos e β-fucosídeos em um mesmo sítio ativo. Com base na comparação entre os Kis e os Kms para celobiose e para pNPβGli e na constância do Km obtido em diferentes pHs, tem-se uma forte evidência que essa enzima opera segundo uma cinética de equilíbrio rápido e não de estado estacionário. O fato da hidrólise da ligação β-glicosídica ocorrer sem inversão da configuração, ocorrer uma grande inibição da celobiase pela δ-gliconolactona e substituintes do radical aglicone influenciarem a constante catalítica sugere que, no mecanismo de catálise da celobiase, há formação de um íon carbônium intermediário e que não há formação de um complexo covalente enzima-substrato.
Título em inglês
Ultrastuctural and enzymatic aspects and physical and kinetic characterization of an intestinal celobiase from Rhynchosciara americana
Palavras-chave em inglês
Animal digestion
Animal intestine
Biochemistry
Diptera
Insects
Resumo em inglês
The gastric caeca of Rhynchosciara americana and other insects are involved in terminal digestion and/or absorption of nutrients. Due to that, their occurrence near the oesophagus is puzzling. One explanation for this should be the existence of an endo-ectoperitrophic circulation of fluids and digestive enzymes as previously proposed for R. americana. In order to support the proposed model of endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes, fine structural and enzymological data on the midgut cells were obtained. Midgut caecal and distal posterior ventricular cells have a similar ultrastructure characterized by large apical microvilli and a basal plasma membrane infolded with associated mitochondria which are, nevertheless, more conspicuous in the apical cytoplasm. The fact that the basal plasma membrane infoldings constitute an extracellular compartment, with few openings into the underlying extracellular space, should permit the cell concentrate solutes in that compartment. The anterior ventricular cells possess small microvilli disposed in the cell apexes and elaborate mitochondria-associated basal plasma membrane infoldings extending almost to the tips of the cells. These infoldings display regular openings into the underlying extracellular space. The proximal posterior ventriculus represents a transition region between the anterior ventriculus and the distal posterior ventriculus. The fine structure of caeca and distal posterior ventricular cells is in accordance to their presumed function in fluid absorption, whereas the fine structure of anterior ventricular cells suggests a function in fluid secretion. Hydrolase assays in microvilli samples prepared from cells of different midgut regions showed that caeca and distal activities for digestive enzymes, suggesting a role in terminal posterior ventricular cells are alike in displaying high specific digestion. In contrast, very low specific activities of digestive enzymes were found in anterior ventricular cells, in accordance to their proposed function in fluid secretion. The results lend support to the model of the endo-ectoperitrophic circulation of digestive enzymes in R. americana. In order to extend our knowledge on protein terminal digestion, the aminopeptidases from cytosol and lumen were found to be similar and to differ from caecal microvillar aminopeptidades. The data support the assumption that the majority of the soluble aminopeptidases from the caecal cells are enzymes en route to their being secreted and only a minor amount would have a typical intracellular function. Caecal plasma membrane-bound cellobiase was chosen to initiate a detailed study of the properties of the enzymes involved in terminal digestion. The Triton X-100-solubilized cellobiase displays a molecular weight of 106.00 and a pI of 5.4, whereas the papaintreated cellobiase shows a molecular weight of 65.000 and a pI of 4.7. The papain-solubilized cellobiase, after being purified by density gradient centrifugation, hydrolyze β-g1ucosides, β-galactosides and β-fucosides in the same active site. The cellobiase seems to operate according to a rapid equilibrium kinetics, since the Km for cellobiose is constant over a wide range of pHs and the Km for cellobiose and pNPβGlu are identical to their Kis in a experiment of competition between substrates. The hydrolysis of the β-g1ucosidic bound occurs without inversion of configuration, δ-gluconolactone is a strong inhibitor of cellobiase and substituints in the substrate aglycone affects the catalytic constant of the reaction. These data support the assumption that the mechanism of the reaction catalysed by cellobiase involves the intermediary formation of a carbônium ion, instead of a glucosyl-enzyme intermediate.
 
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Data de Publicação
2013-08-15
 
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