Neutrophil extracellular traps (NETs) are webs of DNA and cytotoxic proteins released by neutrophils to kill pathogens through a process called NETosis. Studies have shown that the mechanisms of NETosis might be stimulus-dependent. Thus, the stimulus phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) lead to NETs release through activation of the NADPH oxidase, while NETosis caused by calcium ionophores such as ionomycin, occurs without NADPH oxidase activation. Regardless the stimulus, a series of biochemical and structural changes need to occur in neutrophils before the event of NETs release, including chromatin decondensation, and degranulation of cytotoxic proteins. These events are not fully understood, but recent studies have shown cytotoxic proteins associated with NETs can aggravate pathologies and cause vascular damage. Here, we used proteomics studies, live imaging, and fixed microscopy to investigate the early events of NETosis from two different angles. First, an investigation of the biochemical changes that occur upon ionomycin treatment before NETs release was undertaken. Thus, live imaging microscopy showed ionomycin-treated neutrophils rapidly lose their polymorphic nucleus. Moreover, cell fractionation together with proteomic studies pointed to profound biochemical changes seen in and around neutrophil nucleus after 2 minutes of ionomycin treatment, such as cytoskeleton reorganization, nuclear redistribution of actin-remodeling related proteins, and citrullination of actin-ligand and nuclear structural proteins. Second, a comparison of the neutrophils response to three different stimuli, namely PMA, ionomycin, and the peptide N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) was undertaken. Interestingly, the release of NETs occurred after 30 minutes of ionomycin treatment, and after 90 minutes of PMA stimulation. We monitored the cells for up to 120 minutes and the chemotactic peptide fMLP did not induce NETs release. Moreover, only fMLP- and PMA-treated neutrophils activated NADPH oxidase. The analysis of neutrophils secreted proteins after each distinct treatment showed that PMA and fMLP-stimulated neutrophils released more proteins related to neutrophil adhesion and migration, and positive regulation of superoxide activity. In contrast, ionomycin-treated neutrophils had a more cytotoxic secretome, given the enrichment of proteins from azurophilic granules. In conclusion, by exploring the events that happen before NETs release, our studies revealed biochemical mediators involved in this process, and showed that despite leading to the same final outcome, PMA and ionomycin trigger different responses in stimulated neutrophils.

A fim de matar patógenos invasores, neutrófilos liberam redes extracelulares de DNA juntamente com proteínas citotóxicas, conhecidas como NETs (do inglês, neutrophil extracelular traps), em um processo chamado NETosis. Estudos mostram que os mecanismos de NETosis podem ser dependentes de cada estímulo. Assim, o estímulo forbol-12-miristato-13-acetato (PMA) leva à liberação de NETs por meio da ativação da NADPH oxidase, enquanto a NETosis causada por ionóforos de cálcio, como a ionomicina, ocorre sem ativação da NADPH oxidase. Independentemente do estímulo, uma série de mudanças bioquímicas e estruturais precisam ocorrer nos neutrófilos antes do evento de liberação de NETs, incluindo a descondensação da cromatina e a degranulação de proteínas citotóxicas. Tais eventos não estão totalmente compreendidos, mas estudos recentes mostraram que proteínas citotóxicas associadas as NETs podem agravar patologias e causar danos vasculares. Neste trabalho, utilizamos estudos de proteômica, microscopia com células vivas (do inglês, live imaging) e com células fixadas para investigar os eventos iniciais da NETosis por dois ângulos diferentes. Primeiro, foi realizada uma investigação das alterações bioquímicas que ocorrem antes da liberação de NETs após o tratamento com ionomicina. Assim, a microscopia com células vivas mostrou que os neutrófilos tratados com ionomicina perdem rapidamente seu núcleo polimórfico. Além disso, o fracionamento celular juntamente com os estudos proteômicos apontaram para profundas mudanças bioquímicas observadas dentro e ao redor do núcleo dos neutrófilos após 2 minutos de tratamento com ionomicina, tais como a reorganização do citoesqueleto, a redistribuição nuclear de proteínas relacionadas à remodelação da actina e a citrulinação de proteínas ligantes de actina e de proteínas estruturais nucleares. Na sequência, foi realizada uma comparação da resposta dos neutrófilos a três estímulos diferentes, a saber, PMA, ionomicina e o peptídeo N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP). Curiosamente, a liberação de NETs ocorreu após 30 minutos de tratamento com ionomicina e apenas após 90 minutos de estimulação com PMA. Monitoramos as células por até 120 minutos e o peptídeo quimiotático fMLP não induziu a liberação de NETs. Além disso, apenas os neutrófilos tratados com fMLP e PMA ativaram a NADPH oxidase. A análise das proteínas secretadas pelos neutrófilos após cada tratamento mostrou que os neutrófilos tratados com PMA e fMLP liberaram mais proteínas relacionadas à adesão e migração de neutrófilos e regulação positiva da atividade do superóxido. Em contraste, os neutrófilos tratados com ionomicina apresentaram um secretoma mais citotóxico, devido ao enriquecimento de proteínas dos grânulos azurófilicos. Em conclusão, ao explorar os eventos que ocorrem antes da liberação de NETs, nossos estudos revelaram mediadores bioquímicos envolvidos no processo e mostraram que, apesar de levarem ao mesmo resultado final, PMA e ionomicina desencadeiam respostas diferentes em neutrófilos estimulados.