A proliferação é um dos atributos mais fundamentais dos sistemas vivos. Mas, ao contrário dos organismos unicelulares, as células dos organismos complexos param de proliferar, entrando em um estado denominado quiescência, mesmo na presença de nutrientes. Fatores presentes no microambiente celular, como a membrana basal (compartimento especializado da matriz extracelular (MEC) estruturado numa malha de laminina), desencadeiam e sustentam a quiescência, contribuindo para a diferenciação tecidual observada em organismos multicelulares. Para elucidar os mecanismos que fundamentam à aquisição e manutenção da quiescência e da diferenciação celular, nós realizamos um forward genetic screen em células expostas à uma MEC rica em laminina-111 (lrECM) que induz quiescência e diferenciação. Para isso, geramos células epiteliais mamárias não tumorais expressando o sensor fluorescente do ciclo celular FUCCI, assim como um repórter de diferenciação para lactogênese (βCas-CFP). As células foram transfectadas com uma biblioteca lentiviral CRISPR/Cas9 pooled de abrangência genômica e tratadas com lrECM e prolactina por 72h, tempo em que a maioria das células entra em quiescência e se diferenciam. Após isolamento por cell sorting em três populações distintas: mCitrine+ (proliferativa), mCherry+ (quiescente) mCherry+ /CFP+ (quiescente e diferenciada), as células foram sequenciadas para identificação do enriquecimento de guideRNAs que alvejaram genes que medeiam a aquisição de quiescência e diferenciação. Entre os principais candidatos, encontramos genes envolvidos no ciclo celular, organização de células epiteliais e vias metabólicas. Usando o silenciamento pós-transcricional em ensaios baseados em microscopia de fluorescência, validamos novos mediadores de quiescência e diferenciação. Este trabalho expande nossa compreensão básica sobre proteínas sinalizadoras que atuam durante a aquisição da quiescência e diferenciação em contextos fisiológicos, estabelecendo as bases para estudos translacionais em lactação e para o câncer, uma doença em que a regulação da quiescência é perdida.

Proliferation is one of the most fundamental attributes of living systems. But unlike unicellular organisms, complex organisms cells stop proliferating, entering a state termed quiescence, even in the presence of nutrients. Factors present in the cell microenvironment, such as the basement membrane (a specialized extracellular matrix (ECM) compartment assembled over a laminin network), trigger and sustain quiescence, contributing to tissue differentiation observed in multicellular organisms. To elucidate the mechanisms underlying acquisition and maintenance of quiescence and cell differentiation, we performed a forward genetic screen in cells exposed to a laminin-111 rich ECM (lrECM) that induce quiescence and differentiation. For this, we generated non-tumoral mammary epithelial cells expressing the fluorescent cell cycle sensor FUCCI, as well as a differentiation fluorescence reporter for lactogenesis (βCas-CFP). Cells were transfected with a CRISPR/Cas9 genome-wide lentiviral pooled library and treated with lrECM and prolactin for 72h, time that most cells enter quiescence and differentiate. The cells were sorted in three distinct populations: mCitrine+ (proliferative), mCherry+ (quiescent) mCherry+/CFP+ (quiescent and differentiated) and sequenced for determining enrichment of CRISPR guideRNAs targeting genes mediating acquisition of quiescence and differentiation. Among the hits we found genes involved in cell cycle, epithelial cell organization and metabolic pathways. Using gene silencing in fluorescence microscopy-based assays, we validated novel mediators of quiescence and differentiation. This work expands our basic understanding of signaling proteins that act during quiescence and differentiation acquisition in physiological contexts, laying the groundwork for translational studies in lactation and for cancer, a disease in which quiescence regulation is lost.