A proteína Cell Division Cycle 42 (CDC42), pertencente à família das Rho GTPases, está envolvida em diversos processos biológicos relacionados à reorganização do citoesqueleto, proliferação celular, motilidade, polaridade, citocinese e transporte vesicular. Nos últimos anos, Cdc42 tem sido implicada também em cenários de instabilidade genômica, sendo observada a sua superexpressão em diversas células tumorais, bem como a sua interação com importantes supressores tumorais em diferentes contextos celulares. Além disso, estudos recentes indicam a sua participação no envelhecimento precoce de linhagens celulares hematopoiéticas e a possível atuação sobre novas estruturas celulares, em contraposição ao tradicional papel desempenhado na membrana plasmática. Estudos prévios conduzidos por nosso grupo mostraram que mutantes de células HeLa Cdc42 constitutivamente ativos (Cdc42-G12V) apresentam uma maior sensibilidade à radiação ultravioleta em relação aos mutantes selvagens de Cdc42. Além disso, estudos de interactoma e proteômica indicaram a possível interação de Cdc42 com as proteínas PHB-2, 14-3-3η, PAK-4 e Cdc42EP3/Borg2 em condições de instabilidade genômica. Com o intuito de validar molecularmente tais interações por outros métodos experimentais, foram conduzidos ensaios de pull down, ligação de proximidade (PLA) e colocalização por microscopia confocal de fluorescência para as três primeiras proteínas parceiras nas linhagens HeLa Parental e HeLa Cdc42-G12V, tratadas ou não com radiação ultravioleta. Por fim, como forma de validação funcional, promoveu-se a expressão ectópica da parceira Cdc42EP3/Borg2 em ambas as linhagens com o intuito de avaliar a influência desta proteína em particular sobre a sobrevivência celular após o estresse genotóxico. Os resultados experimentais comprovaram a interação das parceiras PHB-2, 14-3-3η e PAK-4 pela GTPase no seu estado ativo, fornecendo indícios de papéis relevantes em estruturas subcelulares pouco exploradas para Cdc42 em condições de instabilidade genômica. Para a efetora Cdc42EP3/Borg2, os resultados obtidos demonstraram que sua interação com Cdc42 possivelmente tem papel no seu envolvimento na sensibilização das células à radiação UVC (sobrevivência celular). Essas respostas também são dependentes da ativação constitutiva de Cdc42 e sugerem que parceiros downstream à Cdc42EP3/Borg2, a exemplo das proteínas Sept2 e NCK1/2, poderiam agir conjuntamente para as respostas celulares observadas após estresse genotóxico. Assim, a comprovação molecular e funcional das interações aqui descritas certamente contribuirá para o melhor entendimento do papel de Cdc42 no contexto de resposta a danos ao DNA, abrindo novas possibilidades para a modulação farmacológica de vias envolvendo essa proteína.

Cell Division Cycle 42 (CDC42), which belongs to the Rho GTPase family, is a wellknown protein involved in cytoskeleton regulation, cell proliferation, motility, polarity, cytokinesis and vesicular transport. In the past years, Cdc42 has been implicated in genomic instability conditions, where its overexpression in cancer cells and its correlation with tumor suppressor proteins have been widely reported. Besides, recent studies indicated that inhibition of Cdc42 prevents premature aging in hematopoietic cell lines and its possible role in the context of novel subcellular localization, including the perinuclear region. Studies conducted by our group demonstrated that Cdc42 constitutively active mutants (Cdc42V12) of HeLa cell line submitted to genotoxic stress exhibit a higher sensibility to ultraviolet radiation in comparison to Cdc42 wild type mutants. Furthermore, interactome and proteomic studies undertaken by our group unveiled a possible interaction of Cdc42 with PHB- 2, 14-3-3η, PAK-4 and Cdc42EP3/Borg2 proteins under genomic instability conditions. In order to experimentally validate these interactions, we conducted pull down assays, proximity ligation assays and fluorescence confocal microscopy for the three protein partners in HeLa Parental and HeLa Cdc42-G12V cell lines with or without ultraviolet radiation. Lastly, ectopic expression of Cdc42EP3/Borg2 was undertaken in both cell lines as a functional validation, with the aim to evaluate the influence of its particular expression towards cell survival following genotoxic stress. The results herein presented proved the preferential interaction of activated Cdc42 with the partners PHB-2, 14-3-3η e PAK-4 as well as indicated that these interactions display relevant roles on subcellular structures fairly unexplored for Cdc42. In the case of Cdc42EP3/Borg2, obtained data demonstrated its involvement in cell sensitization in response to UVC radiation. These responses are also dependent on constitutive activation of Cdc42 and suggest proteins downstream to Cdc42EP3/Borg2, as Septin2 and NCK1/2 proteins, as players that could coordinately act to result in the observed cellular outcomes following genotoxic stress. Therefore, the clarification of the interactions here described will certainly contribute to a better understanding of Cdc42 role in the context of DNA damage response, shedding light on novel possibilities for the pharmacological modulation of pathways involving this protein.