Schistosomiasis is an important parasitic disease with a high impact on morbidity and mortality rates, affecting more than 230 million people in 76 countries. Schistosoma mansoni is the most prevalent species in Africa and Latin America, presenting a complex life cycle with six different stages: eggs, miracidia, sporocysts, cercariae, schistosomula, adult males and adult females (sexual dimorphism). Understanding schistosome biology at the molecular level may suggest new therapeutic alternatives. Long non-protein-coding RNAs (lncRNAs) are RNAs of more than 200 nucleotides with low or no protein-coding potential that, in humans and many other species, can act as regulators of protein-coding gene expression, stem-cell maintenance and drug resistance. Due to their tissue-specific expression and multifaceted functions, lncRNAs have been proposed as new therapeutic targets in human diseases. In this Thesis, we produced a literature review of the works that identified lncRNAs in protozoa, Schistosoma and other helminths, and we demonstrated for the first time the impacts on S. mansoni physiology caused by the in vitro silencing of an intergenic lncRNA (Introduction). We then determined the appropriate reference genes for normalizing RT-qPCR data from samples from the six different developmental stages of S. mansoni (Chapter 1). Further, we showed by re-analyses of public RNA-Seq data from female parasites treated with 5-Aza-Cytidine (an epigenetic drug that inhibits female oviposition and ovarian development), that hundreds of lncRNAs were differentially expressed between control and treated conditions. Many lncRNAs belonged to metabolism-related co-expression modules in males, and some were validated by RT-qPCR (Chapter 2). Subsequently, by reanalyzing public data from single-cell RNA-Seq (scRNA-seq) from adult S. mansoni, we characterized the expression profile of lncRNAs in the 68 identified cell clusters. The cell clusters that contained the most lncRNA markers were male and female gametes and tegument progenitor cells. We identified neural cell-specific marker lncRNAs. By whole mount in situ hybridization, with single or double labeling, we localized the specific expression of 13 of the 16 selected marker lncRNAs (Chapter 3). Finally, re-analysis of public RNA-Seq data from adult worms, recovered from hamsters infected with single-sex or dual-sex cercariae, identified thousands of differentially expressed lncRNAs. We selected twelve lncRNAs and validated their expression levels in a model of in vitro cultures of paired or unpaired parasites that is similar to what performed before. in vitro and in vivo silencing of four of the selected lncRNAs showed that they play key roles in cell proliferation in adult worms and their gonads and are essential for female vitellaria maintenance, adult worm reproduction and egg development. in situ hybridization has shown that these four lncRNAs are expressed in tissues that correlate with the phenotypes observed in the in vitro silencing (Chapter 4). Overall, these results show that lncRNAs are essential components of S. mansoni biology, presenting significant potential as new candidates for therapeutic targets.

A esquistossomose é uma importante doença parasitária com alto impacto nas taxas de morbidade e mortalidade, afetando mais de 230 milhões de pessoas em 76 países. Schistosoma mansoni é a espécie prevalente na África e na América Latina, apresentando um ciclo de vida complexo com seis estágios diferentes: ovos, miracídios, esporocistos, cercárias, esquistossômulos, machos adultos e fêmeas adultas (dimorfismo sexual). A compreensão da biologia do esquistossoma em nível molecular pode sugerir novas alternativas terapêuticas. RNAs longos não-codificadores de proteínas (lncRNAs) são RNAs com mais de 200 nucleotídeos com baixo ou nenhum potencial de codificação de proteínas que, em humanos e muitas outras espécies, podem atuar como reguladores da expressão de genes codificadores de proteínas, manutenção de células-tronco e resistência a drogas. Devido à sua expressão tecido-específica e funções multifacetadas, os lncRNAs foram propostos como novos alvos terapêuticos em doenças humanas. Nesta Tese, produzimos uma revisão bibliográfica dos trabalhos que identificaram lncRNAs em protozoários, em Schistosoma e outros helmintos, e demonstramos pela primeira vez os impactos na fisiologia de S. mansoni causados pelo silenciamento in vitro de um lncRNA intergênico (Introdução). Em seguida, determinamos os genes de referência adequados para a normalização de dados de RT-qPCR de amostras dos seis diferentes estágios de desenvolvimento de S. mansoni (Capítulo 1). Mais adiante, mostramos por re-análises de dados públicos de RNA-Seq de parasitas fêmeas tratadas com 5-Aza-Citidina (uma droga epigenética inibidora da oviposição e desenvolvimento dos ovários das fêmeas), que centenas de lncRNAs eram diferencialmente expressos entre as condições controle e tratado. Muitos lncRNAs pertenciam a módulos de co-expressão relacionados com metabolismo em machos, e alguns foram validados por RT-qPCR (Capítulo 2). Posteriormente, reanalisando dados públicos de RNA-Seq de célula única (scRNA-seq) de S. mansoni adultos caracterizamos o perfil de expressão de lncRNAs nos 68 grupos de células identificados. Os grupos de células que continham a maioria dos lncRNAs marcadores eram gametas masculino e feminino e células progenitoras de tegumento. Identificamos lncRNAs marcadores específicos de células neurais. Por hibridização in situ de parasita inteiro, com marcação simples ou dupla, localizamos a expressão específica de 13 dos 16 lncRNAs marcadores selecionados (Capítulo 3). Por fim a reanálise de dados públicos de RNA-Seq de vermes adultos, recuperados de hamsters infectados com cercárias de um único sexo ou dos dois sexos, identificou milhares de lncRNAs diferencialmente expressos. Selecionamos doze lncRNAs e validamos seus níveis de expressão em um modelo similar de parasitas mantidos pareados ou não em cultivos in vitro. O silenciamento in vitro e in vivo de quatro dos lncRNAs selecionados mostrou que eles desempenham papéis fundamentais na proliferação celular nos vermes adultos e suas gônadas e são essenciais para a manutenção da vitelária das fêmeas, reprodução do verme adulto e desenvolvimento de ovos. Hibridização in situ mostrou que esses lncRNAs são expressos em tecidos que se correlacionam com os fenótipos observados no silenciamento in vitro (Capítulo 4). De modo geral, esses resultados mostram que os lncRNAs são componentes essenciais da biologia do S. mansoni, apresentando potencial significativo como novos candidatos a alvos terapêuticos.