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Tese de Doutorado
DOI
https://doi.org/10.11606/T.46.2022.tde-02122022-164145
Documento
Autor
Nome completo
Phelipe Augusto Mariano Vitale
E-mail
Unidade da USP
Área do Conhecimento
Data de Defesa
Imprenta
São Paulo, 2022
Orientador
Banca examinadora
Salinas, Roberto Kopke (Presidente)
Carvalho, Cristiane Rodrigues Guzzo
Almeida, Fabio Ceneviva Lacerda de
Cuccovia, Iolanda Midea
Título em português
Trocadores de Na+/Ca2+: Relação entre estrutura e função
Palavras-chave em português
Biologia estrutural
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear
Transportadores de membrana
Trocadores de Na+/Ca2+
Resumo em português
Aproximadamente 30% dos genes de organismos eucarióticos e procarióticos codificam para proteínas de membrana, e aproximadamente 60% dos alvos para o desenvolvimento de novas drogas são proteínas de membrana. Apesar disso, as proteínas de membrana correspondem a apenas cerca de 3% das estruturas depositadas no PDB. Os trocadores de Na++/Ca2+ (NCX) são proteínas de membrana absolutamente essenciais para a manutenção da homeostase de Ca2+ em diferentes tipos de células. Eles são formados por 10 hélices transmembranares e uma grande alça citoplasmática. O domínio transmembranar é responsável pelo transporte de Na+ e Ca2+ através da bicamada lipídica, enquanto a alça intracelular é responsável pela regulação alostérica do trocador por Ca2+ intracelular: a ligação de Ca2+ em dois domínios sensores (CBD1 e CBD2) ativa os NCX. Por combinarem domínios transmembranares e globulares conectados por linkers flexíveis, os NCX apresentam um caráter multifacetado, o que torna a sua caracterização estrutural ainda mais difícil. De fato, apesar da reconhecida importância fisiológica, pouco se conhece sobre a estrutura tridimensional dos NCX eucarióticos, e o mecanismo de regulação alostérica permanece pouco compreendido. Nesta tese adotamos o trocador de Drosophila, CALX, como modelo para estudar a estrutura e o mecanismo de regulação alostérica dos trocadores NCX por Ca2+ intracelular. CALX apresenta regulação anômala porque é inibido ao invés de ser ativado por Ca2+ intracelular. Por outro lado, enquanto a ligação de Ca2+ em CBD2 é importante para a regulação alostérica dos NCX, a regulação alostérica do CALX depende exclusivamente da ligação de Ca2+ em CBD1. Para investigar o mecanismo de regulação por Ca2+ intracelular, desenhamos e investigamos por RMN a dinâmica de um mutante do domínio sensor de Ca2+, que contém um linker flexível entre CBD1 e CBD2. Observamos que o linker efetivamente desacoplou a dinâmica entre os dois CBDs, sem afetar significativamente a afinidade por Ca2+. Caracterizamos a atividade dos trocadores NCX e CALX, em células eucarióticas usando técnicas de imageamento de Ca2+. E implementamos um protocolo para a expressão e purificação do trocador Na+/Ca2+ de Methanococcus janaschii (NCX-Mj), isotopicamente enriquecido com 15N, para estudos de RMN em solução. De forma geral, os resultados apresentados nessa tese abrem caminho para a realização de estudos de correlação entre estrutura e função do CALX, e para o estudo do NCX-Mj incorporado em micelas de detergente por RMN em solução.
Título em inglês
Na+/Ca2+ exchangers: Relationship between structure and function
Palavras-chave em inglês
Membrane transporters
Na+/Ca2+ exchangers
Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy
Structural biology
Resumo em inglês
Approximately 30% of the genes from eukaryotic and prokaryotic organisms encode membrane proteins, and approximately 60% of the targets for new drug development are membrane proteins. Despite this, membrane proteins account for only about 3% of all structures deposited in the PDB. Na+/Ca2+ exchangers (NCX) are absolutely essential membrane proteins. They play a key role in the maintenance of Ca2+ homeostasis in different types of cells. The NCX are formed by 10 transmembrane helices and a large cytoplasmic loop. The transmembrane domain is responsible for the transport of Na+ and Ca2+ through the lipid bilayer, while the intracellular loop is responsible for the allosteric regulation of the exchanger by intracellular Ca2+: binding of Ca2+ in a two-domain sensor (CBD12, formed by subdomains CBD1 and CBD2) activates the NCX. The NCX combine a transmembrane domain with globular domains connected by flexible linkers. This multifaceted character makes the NCX structure characterization a difficult task. Despite their recognized physiological importance, little is known about the three-dimensional structure of the eukaryotic NCX, and the mechanism of allosteric regulation remains poorly understood. In this thesis we adopted the exchanger from Drosophila, CALX, as a model system to study the structure and the allosteric regulation mechanism of the eukaryotic NCX. CALX displays anomalous regulation because it is inhibited instead of being activated by Ca2+. In contrast, while Ca2+-binding to CBD2 plays a role in the NCX Ca2+-regulation mechanism, CALX Ca2+ regulation depends only on Ca2+ binding to CBD1. To investigate the NCX Ca2+-regulation mechanism, we designed and investigated the dynamics of a mutant CBD12, containing a flexible linker between CBD1 and CBD2. NMR data indicated that the linker decoupled the dynamics of the two subdomains, while calorimetry data indicated that Ca2+ affinity was not significantly altered by the presence of the linker. The functionality of the NCX and the CALX in eukaryotic cells was examined by Ca2+-imaging. We also developed a protocol for 15N isotopic enrichment of the NCX from Methanococcus janaschii (NCX-Mj). Overall these results open the way to carry out structure-function studies of the CALX, and to investigate the NCX-Mj structure and dynamics using solution NMR spectroscopy.
 
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Data de Publicação
2022-12-19
 
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