Aproximadamente 30% dos genes de organismos eucarióticos e procarióticos codificam para proteínas de membrana, e aproximadamente 60% dos alvos para o desenvolvimento de novas drogas são proteínas de membrana. Apesar disso, as proteínas de membrana correspondem a apenas cerca de 3% das estruturas depositadas no PDB. Os trocadores de Na⁺+/Ca²⁺ (NCX) são proteínas de membrana absolutamente essenciais para a manutenção da homeostase de Ca²⁺ em diferentes tipos de células. Eles são formados por 10 hélices transmembranares e uma grande alça citoplasmática. O domínio transmembranar é responsável pelo transporte de Na+ e Ca²⁺ através da bicamada lipídica, enquanto a alça intracelular é responsável pela regulação alostérica do trocador por Ca2+ intracelular: a ligação de Ca²⁺ em dois domínios sensores (CBD1 e CBD2) ativa os NCX. Por combinarem domínios transmembranares e globulares conectados por linkers flexíveis, os NCX apresentam um caráter multifacetado, o que torna a sua caracterização estrutural ainda mais difícil. De fato, apesar da reconhecida importância fisiológica, pouco se conhece sobre a estrutura tridimensional dos NCX eucarióticos, e o mecanismo de regulação alostérica permanece pouco compreendido. Nesta tese adotamos o trocador de Drosophila, CALX, como modelo para estudar a estrutura e o mecanismo de regulação alostérica dos trocadores NCX por Ca²⁺ intracelular. CALX apresenta regulação anômala porque é inibido ao invés de ser ativado por Ca²⁺ intracelular. Por outro lado, enquanto a ligação de Ca²⁺ em CBD2 é importante para a regulação alostérica dos NCX, a regulação alostérica do CALX depende exclusivamente da ligação de Ca²⁺ em CBD1. Para investigar o mecanismo de regulação por Ca²⁺ intracelular, desenhamos e investigamos por RMN a dinâmica de um mutante do domínio sensor de Ca²⁺, que contém um linker flexível entre CBD1 e CBD2. Observamos que o linker efetivamente desacoplou a dinâmica entre os dois CBDs, sem afetar significativamente a afinidade por Ca²⁺. Caracterizamos a atividade dos trocadores NCX e CALX, em células eucarióticas usando técnicas de imageamento de Ca²⁺. E implementamos um protocolo para a expressão e purificação do trocador Na⁺/Ca²⁺ de Methanococcus janaschii (NCX-Mj), isotopicamente enriquecido com ¹⁵N, para estudos de RMN em solução. De forma geral, os resultados apresentados nessa tese abrem caminho para a realização de estudos de correlação entre estrutura e função do CALX, e para o estudo do NCX-Mj incorporado em micelas de detergente por RMN em solução.

Approximately 30% of the genes from eukaryotic and prokaryotic organisms encode membrane proteins, and approximately 60% of the targets for new drug development are membrane proteins. Despite this, membrane proteins account for only about 3% of all structures deposited in the PDB. Na⁺/Ca²⁺ exchangers (NCX) are absolutely essential membrane proteins. They play a key role in the maintenance of Ca²⁺ homeostasis in different types of cells. The NCX are formed by 10 transmembrane helices and a large cytoplasmic loop. The transmembrane domain is responsible for the transport of Na+ and Ca²⁺ through the lipid bilayer, while the intracellular loop is responsible for the allosteric regulation of the exchanger by intracellular Ca²⁺: binding of Ca²⁺ in a two-domain sensor (CBD12, formed by subdomains CBD1 and CBD2) activates the NCX. The NCX combine a transmembrane domain with globular domains connected by flexible linkers. This multifaceted character makes the NCX structure characterization a difficult task. Despite their recognized physiological importance, little is known about the three-dimensional structure of the eukaryotic NCX, and the mechanism of allosteric regulation remains poorly understood. In this thesis we adopted the exchanger from Drosophila, CALX, as a model system to study the structure and the allosteric regulation mechanism of the eukaryotic NCX. CALX displays anomalous regulation because it is inhibited instead of being activated by Ca²⁺. In contrast, while Ca²⁺-binding to CBD2 plays a role in the NCX Ca²⁺-regulation mechanism, CALX Ca²⁺ regulation depends only on Ca²⁺ binding to CBD1. To investigate the NCX Ca²⁺-regulation mechanism, we designed and investigated the dynamics of a mutant CBD12, containing a flexible linker between CBD1 and CBD2. NMR data indicated that the linker decoupled the dynamics of the two subdomains, while calorimetry data indicated that Ca²⁺ affinity was not significantly altered by the presence of the linker. The functionality of the NCX and the CALX in eukaryotic cells was examined by Ca²⁺-imaging. We also developed a protocol for ¹⁵N isotopic enrichment of the NCX from Methanococcus janaschii (NCX-Mj). Overall these results open the way to carry out structure-function studies of the CALX, and to investigate the NCX-Mj structure and dynamics using solution NMR spectroscopy.