O câncer de pulmão é o câncer que mais mata no mundo todo, e um dos fenótipos mais importantes da oncogênese é a aquisição e conservação de um fenótipo tronco tumoral pelas células iniciadoras de tumor (CITs), que são definidas como células tumorais autorrenováveis capazes de iniciar a formação de tumores, sustentar o crescimento tumoral, conferir quimio e radiorresistência e são responsáveis pela disseminação tumoral. A aquisição do fenótipo tronco tumoral e metastático em células tumorais pulmonares é promovida pela ativação do oncogene KRAS, sendo que mutações ativadoras em KRAS são prevalentes no câncer de pulmão. No entanto, KRAS é um alvo terapêutico pouco drogável e as terapias direcionadas à KRAS oncogênica ainda são escassas e específicas para a mutação G12C. Portanto, a identificação de alvos de KRAS envolvidos em promover o fenótipo maligno é necessária. A quinase Aurora A (AURKA) promove a oncogenicidade e tumorigenicidade das células transformadas por KRAS e também tem sido implicada na aquisição do fenótipo tronco tumoral e metastático. Portanto, nosso objetivo foi avaliar como AURKA afeta o fenótipo tronco tumoral e metastático de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica. Para isso, utilizamos células tumorais pulmonares H1703 com indução (H1703 G12V) ou não (H1703 TrexB) da expressão de KRAS oncogênica e células de câncer de pulmão H358 e A549 portadoras de mutação oncogênica em KRAS. Para avaliar o fenótipo tronco tumoral, realizamos ensaios de formação tumoresferas que permitem o crescimento seletivo de CITs in vitro e observamos que no modelo induzível a inibição de AURKA reduz a capacidade de formação de tumoresferas de maneira KRAS-dependente e nas linhagens A549 e H358 a inibição de AURKA reduz a capacidade de autorrenovação das tumoresferas. Para purificar uma população altamente enriquecida para CITs, nós avaliamos marcadores de superfície de células tronco nessas linhagens, mas não identificamos marcadores que apresentassem uma correlação com o fenótipo tronco tumoral. Como alternativa geramos células H358 e A549 com expressão estável da construção repórter para células tronco tumorais SORE6-GFP, aonde a expressão de GFP é regulada por 6 cópias do elemento de resposta aos fatores de transcrição de célula tronco SOX2 e Oct4 (SORE6). Observamos uma maior proporção de células SORE6-GFP positivas na linhagem H358, indicando que essa linhagem apresenta maior fenótipo tronco tumoral. Células oriundas de tumoresferas enriquecidas para CITs destas linhagens apresentaram maior fenótipo migratório e invasivo, sendo que a inibição de AURKA reduziu a capacidade de migração e invasão tanto das células parentais quanto das populações enriquecidas em CITs. Além disso, a inibição de AURKA na linhagem H358 reduziu a expressão dos fatores pró-angiogêncios IL-8 e VEFG e a capacidade de células endoteliais HUVEC de formarem tubos angiogênicos. A inibição de AURKA na linhagem H358 também reduziu a capacidade migratória das células HUVEC de forma dependente de IL-8 e VEGF. Nossos resultados sugerem que a terapia de inibição de AURKA pode reduzir o fenótipo tronco tumoral e metastático de CITs pulmonares portadoras de KRAS oncogênica e, portanto, pode ser uma estratégia terapêutica atraente para reduzir a recorrência e a metástase no câncer de pulmão induzido por KRAS.

Lung cancer is the the leading cause of cancer deaths worldwide, and one of the most important phenotypes of oncogenesis is the acquisition and maintenance of a cancer stem-like phenotype by tumor initiating cells (TICs), which are defined as self-renewing tumor cells capable of initiating tumor formation, sustaining tumor growth, promoting chemo and radioresistance, and are responsible for tumor spread. The acquisition of a cancer stem-like and metastatic phenotype by lung cancer cells is induced by activation of the KRAS oncogene, and KRAS activating mutations are prevalent in lung cancer. However, KRAS is a poorly druggable therapeutic target and KRAStargeted therapies are scarce and sofar specific for the G12C mutation. Therefore, the identification of KRAS targets involved in promoting the malignant phenotype is warranted. Aurora A kinase (AURKA) promotes oncogenicity and tumorigenicity of KRAS-transformed cells. Furthermore, AURKA has also been implicated in the acquisition of cancer stem-like and metastatic phenotype. Therefore, our goal was to evaluate how AURKA affects the cancer stem-like and metastatic phenotype of pulmonary TICs harboring oncogenic KRAS. For that purpose, we utilized KRASinducible H1703 lung tumor cells with (H1703 G12V) or without (H1703 TrexB) induction of oncogenic KRAS and we also used KRAS-mutant H358 and A549 lung cancer cells. To evaluate the cancer stem-like phenotype, we performed tumorsphere formation assays, that allow for the selective growth of TICs in vitro, and observed that AURKA inhibition in the KRAS-induclible cell model reduces tumorsphere formation in a KRAS-dependent manner and AURKA inhibition in A549 and H358 cells reduces tumorsphere selfrenewal. To purify a population highly enriched for TICs, we analyzed stem cell surface markers in these cell lines, but we were unable to identify surface markers that correlated with the stem-like phenotype. As an alternative, we generated H358 and A549 cells stably expressing the SORE6-GFP stem cell reporter construct, where GFP expression is regulated by 6 copies of the stem cell transcription factors SOX2 and Oct4 response element (SORE6). We observed a higher percentage of SORE6-GFP positive cells in the H358 cell line, indicating that this cell line has a more pronounced stem-like phenotype. Tumorsphere-derived H358 and A549 cells enriched for TICs displayed enhanced migratory and invasive phenotype, and AURKA inhibition reduced migration and invasion of both parental and TIC-enriched cell populations. Furthermore, AURKA inhibition in H358 cells reduced expression of pro-angiogenic factors IL-8 and VEFG and the ability of HUVEC endothelial cells to form angiogenic tubes. AURKA inhibition in H358 cells also reduced HUVEC migration in an IL-8- and VEGF-dependent manner. Our results suggest that AURKA-inhibition therapy can reduce the stem-like and metastatic phenotype of lung TICs harboring oncogenic KRAS and, therefore, may represent a promising therapeutic strategy to reduce recurrence and metastasis in KRAS-induced lung cancer.