This thesis discusses the use of computational and experimental methods for the development of new myeloperoxidase (MPO) inhibitors. MPO is a key enzyme present majority in neutrophil cells. Using hydrogen peroxide, MPO oxidizes chloride generating hypochlorous acid, a strong microbicidal agent. Although MPO has a microbicidal role, its activity is associated to inflammation progression and tissue damage. Beside the oxidation of halides and pseudo-halides in a chlorinating cycle, MPO can oxidize other endogenous substrates, such as urate, ascorbate, serotonin and tyrosine through a peroxidatic cycle. The oxidation of substrates in the peroxidatic cycle produces free radicals and can trigger a free radical chain reaction. In this context, MPO inhibitors emerge as new candidates to anti-inflammatory drugs. To overcome the limitations of the current methodologies available in the search of new MPO inhibitors, a pipeline of several computational and experimental approaches was developed in this thesis. Initially, known potent MPO inhibitors were used to elaborate an inhibitor-like rule. This rule suggests that compounds that match this criterion are more likely to both inhibit MPO and be orally active. By applying this rule to the ZINC12 database, a sub-library of 6546 molecules was recovered. After molecular docking steps, this set was reduced to 242 molecules with good stereospecificity for the active site of MPO. In a first experimental validation, 10 compounds were tested and 6 inhibited MPO chlorinating activity. The most potent compound, ZINC9089086, reversibly inhibited the enzyme with a IC₅₀ = 2.2 µM. It also inhibited hypochlorous acid production by cells. To confirm the predictability of the virtual screening methodology, 18 additional compounds were selected. Confirming the methodology robustness, 12 of these compounds inhibited the chlorinating activity of the enzyme, while 13 inhibited the peroxidatic one. The most potent compounds, RL6 and RL7, exhibited IC₅₀ in the nanomolar range (270 nM and 560 nM, respectively). Both compounds decreased hypochlorous acid production and NETosis in dHL-60 cells and peripheral blood neutrophils. Mechanistic studies indicate that RL6 is a reversible non-oxidizable MPO inhibitor, while RL7 is an hypochlorous acid scavenger. To confirm that the MPO inhibitor-like rule do not only select MPO inhibitors but also in vivo active compounds, a murine model of gouty arthritis was used. Corroborating our hypothesis, all tested compounds (RL6, RL7, RL21 and ZINC9089086) inhibited paw edema when administered intraperitoneally and 3 compounds were also orally active (RL6, RL7 and RL21). Finally, the integration of computational and experimental methods has proven to be a golden approach for the discovery of in vivo active MPO inhibitors.

Esta tese disserta acerca do uso de métodos computacionais e experimentais para o desenvolvimento de novos inibidores da mieloperoxidase (MPO). A MPO é uma enzima chave na inflamação, ela está presente em neutrófilos e usa o peróxido de hidrogênio para oxidar cloreto ao ácido hipocloroso, um forte agente microbicida. Embora a MPO possua um importante papel no controle de infecções, sua atividade está associada ao descontrole da inflamação e ao dano tecidual. Além de catalisar a oxidação de haletos e pseudo-haletos através de um ciclo clorinante, a MPO pode oxidar outros substratos endógenos como urato, ascorbato, serotonina e tirosina através do ciclo peroxidásico. A oxidação de substratos via ciclo peroxidásico produz radicais livres, sendo um gatilho à reação em cadeia de radicais livres. Nesse contexto, inibidores da MPO surgem como novos candidatos anti-inflamatórios. Assim, para superar as limitações de metodologias prévias na busca de novos inibidores da MPO, um fluxo de trabalho utilizando diversas abordagens computacionais e experimentais foi desenvolvido. Inibidores já reportados para a MPO permitiram a elaboração de uma regra MPO inibidor-símile. Compostos que satisfazem essa regra possuem maior probabilidade de inibição e de atividade in vivo. A aplicação desta regra ao banco de dados ZINC12 recuperou uma sub-biblioteca de 6546 moléculas. Após etapas de docagem molecular, esse conjunto foi reduzido para 242 moléculas. Em uma validação experimental inicial, 10 compostos foram testados e 6 inibiram a atividade clorinante. O composto mais potente, ZINC9089086, exibiu um modo de inibição reversível, com um IC₅₀ de 2,2 µM, além de inibir a produção de ácido hipocloroso produzido por células. Para confirmar a previsibilidade da metodologia, 18 novos compostos foram selecionados. Confirmando a robustez da metodologia, 12 desses compostos foram ativos no ensaio de atividade clorinante da enzima, enquanto 13 inibiram a atividade peroxidásica. Os compostos mais potentes, RL6 e RL7, exibiram IC₅₀ na faixa nanomolar (270 nM e 560 nM, respectivamente) e os ensaios celulares também indicaram modulação na produção/disponibilidade do ácido hipocloroso e na NETose. Estudos mecanísticos indicaram que RL6 é um inibidor reversível e que não é oxidado pela enzima ou pelo produto da reação. Enquanto RL7 é um sequestrante de ácido hipocloroso. Para confirmar que a regra inibidorsímile não apenas seleciona inibidores in vitro, mas também compostos ativos in vivo, foi usado um modelo murinho de artrite gotosa. Corroborando nossa hipótese, todos os compostos testados (RL6, RL7, RL21 e ZINC9089086), inibiram o edema de pata quando administrados por via intraperitoneal e 3 também foram oralmente ativos (RL6, RL7 e RL21). Finalmente, a integração de métodos computacionais e experimentais provou ser uma abordagem de ouro para a descoberta de inibidores de MPO ativos in vivo.