Enzimas são catalisadores de reações químicas, cuja atividade é sensível a sua sequência de aminoácidos, estado oligomérico e as condições do meio em que se encontram, e.g., temperatura e força iônica. Fundamentalmente, populações estatisticamente discretas com conformações distintas influenciam e conferem estados de maior e menor atividade à enzima. Nesta tese, são discutidos em dois tipos de enzimas as interrelações entre mutações, conformações e atividade catalítica. No capítulo I, é examinada uma β-glicosídeo hidrolase de Spodoptera frugiperda (Sfβgly) expressa e purificada em sistema heterólogo (E. coli), a qual sua atividade é sensível ao seu estado oligomérico. Além disso, mutações acumulativas em sua sequência são capazes de alterar sua estereosseletividade frente a substratos sintéticos. Os resultados indicam que a Sfβgly em solução forma um equilíbrio de estado entre dímero e monômero com uma constante de dissociação (K_D) de 3,7±0,3 µM, sendo a forma dimérica cerca de 2,5 vezes mais ativa comparada com seu estado monomérico quando separadas por filtração em gel. Contudo, a constante cinética de dissociação do dímero (k_off) estimada em 277·10^-6 s^-1 sugere que para alcançar o estado monomérico é preciso passar por uma elevada barreira de energia de ativação (E_a) de cerca de 18,5 kcal. A explicação deste fenômeno tem respaldo na teoria de que proteínas possuem estados conformacionais, e no caso da Sfβgly, o estado dimérico e monomérico possuiriam diferentes conformações que também estariam associadas com a atividade da enzima. Mutações na interface do dímero planejadas para desestabilizar a ligação entre as subunidades validam que a atividade do monômero é menor comparada à fração contendo dímeros da enzima selvagem. Ainda com respeito a mutações, uma variante da Sfβgly com 47 mutações acumuladas na sua sequência gerou uma enzima monomérica e com capacidade de hidrolisar substrato com ligação αglicosídica, uma função rara entre as β-glicosidases. No capítulo II, a temática gira em torno de mutações em uma tirosina quinase que conferem resistência a medicamentos (inibidores) para tratamento da Leucemia Mieloide Crônica (CML). O causador da CML e o alvo terapêutico é um domínio tirosina quinase da enzima Abl1-KD, que é constitutivamente ativa nesta doença. Para entender como as mutações de resistência atuam nas diferentes conformações da Abl1-KD, simulamos computacionalmente com o Rosetta o efeito estabilizador de mutações no resíduo e da estrutura no contexto da conformação. Além disso, através da inferência das sequências ancestrais de Abl1-KD, verificamos se as posições da estrutura primária mais conhecidas em conferir resistência aos inibidores sofrem algum grau de constrição evolutiva. Os resultados mostram que a energia conformacional da forma inativa estimada pelo Rosetta é 4,4 ± 2,2 REU (Rosetta Energy Units) mais estável comparada à conformação ativa, indicando que a conformação inativa é mais populada. Interessantemente, as mutações em posições que conhecidamente conferem resistência aos inibidores de tratamento da CML são capazes de remodelar a energia conformacional da Abl1-KD, tornando a conformação ativa mais estável, como no caso das mutações: M244V, G250E, Q252H, Y253H, F359VC e H396P. Em relação à energia individual dos resíduos, as mutações G250E, Q252H, Y253H, E255V, V299L, F359(C,V), e H396P estão mais estáveis na conformação ativa da Abl1-KD. Finalmente, a história evolutiva da Abl1-KD inferida por filogenia indica que as posições conhecidas por gerar resistência possuem uma menor taxa de variação de resíduo através de análise por matriz de peso scoreposição (PSSM). Em conclusão, mutações na Abl1-KD capazes de remodelar sua energia conformacional estabilizando sua forma ativa, ocorrem em posições moderadamente conservadas que são responsáveis por estabilizar a forma inativa da enzima, e estão envolvidas no fenótipo de resistência observado após abrupta pressão seletiva imposta pelos inibidores de quinases.

Enzymes that catalyze chemical reactions, whose activity is sensitive to their amino acid sequence, oligomeric state and the conditions of the medium in which they are found, e.g., temperature and ionic strength. Fundamentally, statistically discrete populations with distinct conformations influence and confer states of greater and lesser activity to the enzyme. In this thesis, the interrelations between mutations, conformations and catalytic activity are discussed in two types of enzymes. In chapter I, a βglycoside hydrolase from Spodoptera frugiperda (Sfβgly) expressed and purified in a heterologous system (E. coli) is examined, which its activity is sensitive to its oligomeric state. Furthermore, cumulative mutations in its sequence can alter its stereoselectivity against synthetic substrates. The results indicate that Sfgly in solution forms an equilibrium of state between dimer and monomer with a dissociation constant (K_D) of 3.7±0.3 µM, the dimeric form being about 2.5 times more active compared to its monomeric state when separated by gel filtration. However, the kinetic dimer dissociation constant (k_off) estimated at 277·10^-6 s^-1 suggests that to reach the monomeric state it is necessary to pass through a high activation energy barrier (E_a) of about 18.5 kcal. The explanation of this phenomenon is supported by the theory that proteins have conformational states, and in the case of Sfβgly, the dimeric and monomeric state would have different conformations that would also be associated with the enzyme activity. Mutations in the dimer interface designed to destabilize the binding between the subunits validate that the monomer activity is lower compared to the fraction containing wild-type enzyme dimers. Still regarding mutations, a variant of Sfβgly with 47 accumulated mutations in its sequence generated a monomeric enzyme capable of hydrolyzing substrate with α-glycosidic bond, a rare function among β-glycosidases. In chapter II, the theme revolves around mutations in a tyrosine kinase that confer resistance to drugs (inhibitors) for the treatment of Chronic Myeloid Leukemia (CML). The causative agent ofCML and the therapeutic target is a tyrosine kinase domain of the enzyme Abl1- KD, which is constitutively active in this disease. To understand how resistance mutations act on the different conformations of Abl1-KD, we computationally simulated with Rosetta the stabilizing effect of mutations in the residue and structure in the context of the conformation. Furthermore, by inferring Abl1-KD ancestral sequences, we verified whether the primary structure positions best known to confer resistance to inhibitors suffer some degree of evolutionary constriction. The results show that the total conformational energies of the inactive form estimated by Rosetta is 4.4 ± 2.2 REU (Rosetta Energy Units) more stable compared to the active conformation, indicating that the inactive conformation is more populated. Interestingly, mutations in positions that are known to confer resistance to CML treatment inhibitors are capable of remodeling the conformational energy of Abl1-KD, making the active conformation more stable, as in the case of mutations: M244V, G250E, Q252H, Y253H, F359VC and H396P. Regarding the individual energy of the residues, mutations G250E, Q252H, Y253H, E255V, V299L, F359(C,V), and H396P are more stable in the active conformation of Abl1-KD. Finally, the evolutionary history of Abl1-KD inferred by phylogeny indicates that positions known to generate resistance have a lower rate of residue change via weight scoreposition matrix (PSSM) analysis. In conclusion, mutations in Abl1-KD capable of remodeling its conformational energy stabilizing its active form, occur in moderately conserved positions that are responsible for stabilizing the inactive form of the enzyme, and are involved in the resistance phenotype observed after abrupt selective pressure imposed by inhibitors of kinases.