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Tesis Doctoral
DOI
https://doi.org/10.11606/T.43.2019.tde-15102019-170824
Documento
Autor
Nombre completo
Gustavo Scanavachi Moreira Campos
Dirección Electrónica
Instituto/Escuela/Facultad
Área de Conocimiento
Fecha de Defensa
Publicación
São Paulo, 2019
Director
Tribunal
Itri, Rosangela (Presidente)
Baptista, Mauricio da Silva
Barbosa, Leandro Ramos Souza
Oliveira Neto, Mario de
Paula, Eneida de
Título en portugués
O papel de lipídios oxidados e surfactantes como promotores de agregados proteicos tipo amilóide
Palabras clave en portugués
Agregação de Proteína
Amilóide
Fluorescência
lipídeo oxidado
SAXS
Resumen en portugués
Esta tese de doutoramento aborda (i) a formação de agregados proteicos de albumina de soro bovina (BSA) induzida pela ação de sufactantes aniônicos, (ii) o impacto da presença de lipídeos oxidados em membranas, e (iii) a indução de formação de fibra amiloide do polipeptideo das ilhotas humano (IAPP) por membranas miméticas. As principais técnicas utilizadas foram espalhamento de raio-X a baixos ângulos (SAXS) e fluorescência. Determinamos por SAXS que a adição de SDS ou SPFO em solução de BSA, pH 3.7, induz a formação de agregados que são maiores na presença do SDS. Estes resultados foram confirmados por medidas de turbidez e de microscopia eletrônica. Em paralelo, medidas de dicroísmo circular e fluorescência do Th T indicaram presença maior de folhas b nos agregados induzidos por SPFO. Assim sendo, sugerimos que o SPFO é mais eficiente em induzir agregados do tipo amilóide em BSA devido a sua estrutura ser mais rígida do que a do SDS, restringindo assim o movimento das cadeias polipeptídicas da BSA e favorecendo a formação de estruturas ordenadas. Em termos do impacto de lipídeos oxidados em membranas miméticas, estudamos membranas compostas por diferentes razões molares POPC:lipídeo oxidado à temperatura de 23oC e 37oC. Os lipídeos oxidados foram: POPC hidroperoxidado (POPC-OOH) e lipídeos de cadeia alquila oxidadas encurtadas PAZEPC e POVPC, que possuem grupos carboxila e aldeído no terminal das cadeias, respectivamente. Para membranas contendo POPC-OOH, os resultados de anisotropia resolvida no tempo da sonda TMA-DPH, de TRES da sonda laurdan e dos perfis de densidade eletrônica (½(r)) obtidos a partir das análises de SAXS, indicam que o grupo OOH do lipídeo oxidado POPC-OOH está localizado na região da interface membrana/solvente. Com o aumento da concentração do POPC-OOH na membrana lipídica, há diminuição da anisotropia residual (r1) e do tempo de vida de fluorescência do TMA-DPH sugerindo um aumento progressivo na penetração de água na interface da membrana e/ou a interação da sonda com o grupo OOH do lipídeo oxidado. De maneira interessante, os perfis de densidade eletrônica das membranas POPC:POPC-OOH apresentam um decréscimo na espessura da bicamada lipídica com aumento da quantidade de POPC-OOH na membrana, acompanhado de um aumento de densidade eletrônica na região dos grupos CH2. As análises das funções de correlação vertical (perpendicular à superfície da membrana) de vesículas multilamelares, obtidas dos experimentos de SAXS, revelaram um aumento da flutuação da membrana e diminuição do módulo de curvatura (KC) de cerca de 5 x 10-20 J para membranas compostas por POPC para 1 x 10-20 J para membranas contendo POPC-OOH. A presença dos lipídeos oxidados PAZEPC e POVPC induziu aumento no grau de hidratação na interface da membrana, como inferido pelas análises dos espectros de fluorescência. Não foi possível obter uma clara indicação da localizacão dos grupos oxidados de PAZEPC e POVPC na membrana. Além disso, a introdução do PAZEPC e POVPC nas membranas de POPC induziu decréscimo de correlação entre as bicamadas lipídicas observadas por SAXS, extinguindo-se em membranas contendo 25% de PAZEPC. Sendo assim, estes dois lipídeos devem aumentar expressivamente a flutuação da membrana impedindo seu empilhamento. Além disso, a presença do PAZEPC pode também induzir carga na superfície de membrana dificultando a formação de MLVs. Por fim, os resultados de cinética de fibrilação de IAPP mostraram que as membranas compostas por lipídeo aniônico POPS aceleram o processo de formação da fibra amiloide na razão molar 10:1 (lipídeo:IAPP), com desaceleração para razões molares superiores. Entretanto, os mesmos experimentos realizados com as membranas oxidadas, caracterizadas neste trabalho, foram inconclusivos, pois não obtivemos reprodutibilidade nos resultados.
Título en inglés
The role of oxidized lipids and surfactants as promoters of amyloid-like protein aggregates
Palabras clave en inglés
Amyloid
Fluorescence
Oxidized Lipids
Protein Aggregation
SAXS
Resumen en inglés
Here we studied (i) the formation of bovine serum albumin (BSA) aggregates induced by the action of anionic sufactants, (ii) the impact of the presence of oxidized lipids in biomembranes as well as (iii) the induction of amyloid fiber formation of the human islet polypeptide (IAPP) by mimetic biomembranes. The main techniques employed were small angle X-ray scattering (SAXS) and fluorescence. Our results from protein aggregates showed that addition of SDS or SPFO to BSA solution, at pH 3.7, induced the aggregation which are greater in the presence of SDS. On the other hand, measurements of circular dichroism and Th T fluorescence indicated higher degree of b-sheets in the SPFO induced aggregates. Thus, we suggest that SPFO is more efficient in inducing BSAs amyloid like aggregates due its bulkier structure as compared to SDS, thereby restricting the movement of BSA polypeptide chains and favoring the formation of ordered structures. In terms of the impact of oxidized lipids on mimetic membranes, we studied membranes composed of different POPC:oxidized lipid molar ratios at two temperatures: 23oC and 37oC. The oxidized lipids were: hydroperoxidized POPC (POPC-OOH) and truncated oxidized alkyl chain lipids PAZEPC and POVPC, which have a carboxyl and aldehyde group at the chain terminus, respectively. For POPC-OOH containing membranes, time resolved anisotropy results from TMA-DPH probe, TRES from laurdan probe and electron density profiles (½(r)) obtained from the SAXS analyzes, indicate that the OOH group of the oxidized lipid POPC-OOH is located in the region of the membrane/solvent interface. As the POPC-OOH concentration increases in the lipid membrane, there is a decrease in the residual anisotropy (r1) and in the fluorescence lifetime of the TMA-DPH suggesting a progressive increase in water penetration at the membrane interface and/or the interaction of the probe with the OOH group of the oxidized lipid. Interestingly, the electron density profiles of the POPC-OOH membranes show a decrease in lipid bilayer thickness with increasing amount of POPC-OOH in the membrane, accompanied by an increase in electron density in the region of the CH2 groups. An inspection of the vertical correlation functions (perpendicular to membrane surface) of multilamellar vesicles, obtained from the SAXS experiments, revealed an increase in membrane fluctuations and decrease in the bending modulus (KC) of about 5 x 10-20 J for membranes composed of POPC to 1 x 10-20 J for membranes containing POPC-OOH. The presence of the oxidized lipids with truncated aliphatic chain, PAZEPC and POVPC, induced an increase in the degree of hydration at the membrane interface inferred by the fluorescence spectra. We did not obtain a clear indication of the location of the oxidized groups of PAZEPC and POVPC in the membrane. In addition, the introduction of PAZEPC and POVPC in POPC membranes induced a decrease in correlation between the lipid bilayers as observed by SAXS, extinguishing in membranes containing 25% PAZEPC. Therefore, these two lipids must expressively increase the membrane fluctuation preventing their stacking. In addition, the presence of PAZEPC may also induce charge on the membrane surface, making it difficult to form MLVs. Finally, IAPP fibrillation kinetics results showed that membranes composed of anionic lipid POPS accelerates the process of amyloid fiber formation, in 10:1 (lipid: IAPP) molar ratio , with deceleration at higher molar ratios. However, the same experiments performed with the oxidized membranes, characterized in this work, were inconclusive, since no reproducible results were obtained.
 
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Fecha de Publicación
2019-12-20
 
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