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Doctoral Thesis
DOI
https://doi.org/10.11606/T.43.2020.tde-01062020-160220
Document
Author
Full name
Raffaela De Rosa
E-mail
Institute/School/College
Knowledge Area
Date of Defense
Published
São Paulo, 2020
Supervisor
Committee
Itri, Rosangela (President)
Barbosa, Leandro Ramos Souza
Ciancaglini, Pietro
Lopes, José Luiz de Souza
Tsubone, Tayana Mazin
Title in Portuguese
Danos físicos em membranas por processos de fotossensibilização
Keywords in Portuguese
Dissociação de proteína
Domínio lipídico
Foto-oxidação
Lipídio oxidado
SAXS
Abstract in Portuguese
Nesta tese de doutoramento, utilizamos a técnica de espalhamento de raios-x a baixos ângulos (SAXS) para: (i) caracterizar membranas modelo (vesículas unilamelares grandes, LUVs) compostas por POPC (PC), PC:esfingomielina (PC:SM, razão molar 1:1) e PC:SM:colesterol (PC:SM:CO, 1:1:1), (ii) estudar mudanças estruturais nestas membranas devido à foto- oxidação in situ na presença de quatro fotossensibilizadores (FS): azul de metileno (MB), azures A e B (AA e AB) e tionina (Ti), (iii) avaliar do ponto de vista estrutural a influência dos lipídios oxidados PC-OOH (POPC hidroperoxidado) e 1-palmitoil-2-azelaoil-sn-glicero- 3-fosfatidilcolina (PAzPC) na composição da membrana lipídica e (iv) investigar os mecanismos de interação e agregação da enzima gliceraldeido-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) na superfície de membranas oxidadas e contendo domínios lipídicos. A caracterização inicial de membranas modelo mostrou que a composição lipídica influencia nos parâmetros estruturais como espessura de bicamada e perfil de densidade eletrônica. Bicamadas lipídicas compostas apenas por POPC apresentaram espessura de bicamada lipídica igual a 46(2)Å. Em sistemas compostos por PC:SM (1:1) foi evidenciado aumento de 6.6Å na espessura da bicamada. No caso de membranas compostas por PC:SM:CO (1:1:1) a análise das curvas de SAXS indicou uma coexistência de fases liquido desordenado (Ld)-liquido ordenado (Lo), com diferenças na espessura da bicamada de 9.4Å. No estudo de fotossensi- bilização de membranas, foram analisadas curvas de SAXS de LUVs de PC, PC:SM (1:1) e PC:SM:CO (1:1:1) foto-irradiadas por 2h na presença dos FS MB, AA, AB e Ti. Vesículas compostas por PC:SM:CO apresentaram menor alteração estrutural sugerindo que a presença de domínios lipídicos de SM:CO protegem a bicamada lipidica dos efeitos de foto-oxidação. Ressalta-se aqui que CO també é alvo de foto-oxidação. Para os sistemas PC e PC:SM, o FS Tionina promoveu maior foto-dano na membrana resultando em oxidação lipídica de cerca de 31% para membranas de POPC e de 17% para PC:SM. Foi observado efeito de indução à formação de multilamelas para todas as composições lipídicas com FSs mesmo antes da exposição à foto-irradiação, sugerindo que o FS por si só promove formação de multilamelas. De um modo geral, os efeitos de fotossensibilização observados neste estudo não foram significativos no que se refere a danos físicos em membranas em termos de ruptura das mesmas. Em termos do impacto de lipídio oxidado em membranas modelo, foi observado que a adição controlada de POPC-OOH em bicamadas de POPC leva à diminuição da espessura da bicamada de 46.4(6)Å para membranas puras de PC para 37.6(4)Å quando compostas por 100% de PC-OOH. No caso do sistema PC:PAzPC (67:33) foi obtida espussura de bicamada igual a 42.7(9)Å. Para os sistemas ternários PC:PC-OOH:PAzPC (60:25:15) e (47:25:28) foram observadas espessuras equivalentes aos valores obtidos para PC com 33% de lipídio oxidado (PC-OOH ou PAzPC). A análise dos sistemas PC:PC-OOH e PC:PAzPC via modelo de grupos químicos mostrou que o grupo oxidado OOH do PC-OOH se encontra preferencialmente na região polar da membrana, próximo aos grupos carbonila e fosfato. No caso do PAzPC, o grupo COO apresentou uma distribuição bimodal com localização nas regiões hidrofóbica e hidrofílica da membrana. Por fim, o estudo de interação GAPDH/PC:PC-OOH mostrou que a GAPDH sofre agregação ao longo do tempo de observação independente do nível de oxidação da membrana. A quantificação da estrutura oligomérica da enzima mostrou que na presença de membranas contendo PC-OOH a enzima sofre dissociação da forma inicial de tetrâmero para monômeros ou dímeros, não sendo possível a distinção entre os dois. Para medidas realizadas diretamente após a mistura das soluções (t = 0h) foi observada maior dissociação para vesículas com menor grau de oxidação (PC-PC-OOH (67:33)). Em sistemas compostos por PC:SM:CO e PC-OOH:SM:CO a GAPDH manteve a estrutura de tetrâmero mesmo após 2h de interação indicando que a formação de domínios lipídicos inibe a dissociação da enzima em monômeros ou dímeros.
Title in English
Physical damage to membranes by photosensitization processes
Keywords in English
Lipid domain
Oxidized Lipids
Photo-oxidation
Protein dissociation
SAXS
Abstract in English
Small angle x-ray scattering (SAXS) technique was here applied to (i) characterize model membranes (large unilamellar vesicles LUVs) composed of POPC (PC), PC:sphingomyelin (PC:SM, 1:1) and PC:SM:cholesterol (PC:SM:CO, 1:1:1), (ii) study structural changes in these membranes due to in situ photo-oxidation in the presence of four photosensitizers (FS): methylene blue (MB), azure A and B (AA and AB) and thionine (Ti), (iii) evaluate the influence of the oxidized lipids PC-OOH (hidroperodidated POPC) and 1-palmitoyl-2-azelaoyl- sn-glycero-3-phosphocholine (PAzPC) on the composition of the lipid membrane and (iv) investigate the interaction and aggregations mechanisms of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) enzyme on the surface of oxidized membranes and membranes containing lipid domains. The initial characterization of model membranes showed that the lipid composition affects structural parameters like membrane thickness and electron density distribution. Lipid bilayers composed only of POPC had a lipid bilayer thickness equal to 46(2)Å. Compared to the PC system, membrane composed of PC:SM (1:1) showed an increase of 6.6Å in the bilayer thickness. In the case of membranes composed by PC:SM:CO (1:1:1) the analysis of the SAXS curves indicated a coexistence of Ld-Lo phases, with differences in the bilayer thickness of 9.4Å. For membrane photosensitization study, we analyzed SAXS curves of LUVs composed of POPC, PC:SM (1:1) and PC:SM:CO (1:1:1) photo-irradiated for 2h in the presence of FS MB, AA, AB and Ti. Vesicles composed by PC:SM:CO presented lower structural alteration due to photosensitivity, suggesting that lipid domains of SM:CO hinder membrane damage. PC and PC:SM systems, the FS Ti promoted the greatest photo-damage in the membrane, resulting in lipid oxidation of about 31% for POPC membranes and 17% for PC:SM. It was observed an induction to formation of multilamellar structures for all lipid compositions with FSs even before exposure to photo- irradiation, suggesting that FS by itself promotes the multilamella formation. In general, the photosensitization effects observed in this study were not significant with regard to physical damage to membranes in terms of rupture. In terms of the impact of oxidized lipid on model membranes, it has been observed that the controlled addition of POPC-OOH to POPC bilayers leads to a decrease in the layer thickness of 46.4(6)Å for pure PC membranes to 37.6(4)Å when composed of 100% PC-OOH. For PC:PAzPC (67:33) we obtained bilayer thickness of 42.7(9)Å. For the ternary mixtures of PC:PC-OOH:PAzPC (60:25:15) and (47:25:28), the bilayer thickness was similar to that obtained for PC with 33% of oxidized lipid (PC-OOH or PAzPC). Analysis of PC:PC-OOH and PC:PAzPC systems taking into account the scattering of the chemical groups showed that the oxidized group OOH of the PC-OOH is placed preferably in the polar region of the membrane, close to the carbonyl and phosphate groups. In the case of PAzPC, the COO group presents a bimodal distribution with location in the hydrophobic and hydrophilic regions of the membrane. Finally, the GAPDH/PC:PC-OOH interaction study showed GAPDH aggregation regardless the membrane oxidation. Quantification of the enzymes oligomeric structure in the presence of membranes containing PC:PC-OOH showed dissociation from the tetrameric structure to monomers or dimers, without the possibility of distinguishing between the two structures. For measurements performed directly after mixing the solutions (t = 0h), the greatest enzyme dissociation was observed for lower oxidized membranes (PC-PC-OOH (67:33)). In systems composed of PC:SM:CO and PC-OOH:SM:CO under 2h of interaction the GAPDH kept the tetrameric structure, suggesting that lipid domains inhibit the enzyme dissociation in monomers or dimers.
 
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Publishing Date
2020-07-29
 
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