A dor neuropática apresenta-se como uma das condições mais difíceis ao tratamento antálgico, por ganhar um caráter crônico e implicar na qualidade de vida geral, o que faz necessário novos tratamentos eficazes. A neuroestimulação é capaz de alterar a atividade das vias modulatórias de dor, potencialmente promovendo analgesia. A Estimulação Elétrica do Córtex Insular (EECI) induz antinocicepção e influencia a atividade neuronal de áreas encefálicas, indicando a ínsula como alvo iminente para modulação da dor. Este trabalho teve por objetivo avaliar a participação da transmissão GABAérgica na antinocicepção promovida pela EECI repetitiva, avaliar alterações neuroplásticas e em células astrocitárias, bem como avaliar a presença de projeções excitatórias e inibitórias entre a ínsula e o córtex do cíngulo anterior (ACC) modulatórias de dor. Ratos machos, Sprague Dawley (280-340g; CEUA 3447131117), submetidos à constrição crônica do nervo isquiático direito (CCI) receberam um eletrodo concêntrico na ínsula posterior esquerda (1.0 mm caudal ao bregma, 5.8 mm de lateralidade, 7.1 mm de profundidade) e foram submetidos a cinco estimulações diárias, consecutivas (15 min, 60 Hz, 210 s, 1V). Metiodeto de bicuculina, antagonista de receptores GABAA, (0.1ug, i.t) administrado 1 h antes do teste de pressão de pata induziu reversão da antinocicepção induzida pela EECI, sem alterar a atividade geral no teste de campo aberto. Aumento de GAD65 na ínsula após EECI foi observado por imunofluorescência, sem alterações de GFAP, sinaptofisina e tirosina-hidroxilase (TH) na ínsula, hipocampo, cíngulo anterior e medial, Substância Cinzenta Periaquedutal (PAG) e Bulbo Rostral Ventromedial (RVM). A análise por western blotting não revelou alterações de GAD65 após EECI. Níveis de GABA, glutamato e glicina analisados por cromatografia líquida de alta performance (High Performance Liquid Chromatograph(- HPLC) não se alteraram após EECI. Em colaboração com a Universidade de Calgary, camundongos GAD2CrexAi9, PVCrexAi9, Vglut2CrexAi9 foram submetidos à lesão parcial do nervo isquiático esquerdo (Spared Nerve Injury- SNI) e à injeção de traçador toxina colérica- subunidade B (CTB488). Foi demonstrado a presença de projeções GABAérgicas, parvalbumina positivas (PV+) e glutamatérgicas entre a ínsula e o ACC, as quais não se apresentaram ativadas por c-Fos em ensaio de imunofluorescência. Camundongos GAD2Cre, PVCre, e Vglut2Cre receberam títulos com vetor viral para expressão de opsina (pAAV9-EF1a-DIO-hChR2(H134R)-eYFP) na ínsula direita e uma fibra óptica foi implantada na ínsula (0.5 mm posterior ao bregma, 0.375 de lateralidade, 4.0 mm de profundidade) ou ACC direito (1.055 mm anterior ao bregma, 0.255 mm de lateralidade, 1.522 mm de profundidade). Animais foram submetidos ao SNI e 6 a 8 semanas após a injeção do vírus, à optostimulação (lasers azuis DPSS 472 nm, 5mW, 10Hz ou 40Hz). A ativação optogenética de neurônios PV+ induziu preferência condicionada ao lugar, sem alterar o limiar mecânico no teste de sensibilidade mecânica (anestesiômetro digital plantar- Digital Plantar Anesthesiometer DPA). Os resultados salientam que a sinalização GABAérgica participa parcialmente da analgesia induzida pela EECI bem como demonstram a presença de projeções GABAérgicas, PV+ e glutamatérgicas entre a ínsula e o ACC, e sua influência sobre a modulação da dor em modelos de dor neuropática.

Neuropathic pain presents itself as one of the most difficult conditions for antalgic treatment, as it has a chronic character and impairs the general quality of life, which requires brandnew effective treatments. Neurostimulation has the ability to alter the activity of pain modulatory pathways, potentially promoting analgesia. In this context, it has been demonstrated that electrical stimulation of the insular cortex (ESI) induces antinociception as well as it influences neuronal activity of brain areas, pointing insula as na iminente target for pain modulation. Herein, we aimed to evaluate the participation of GABAergic neurotransmission in repetitive ESI antinociceptive effects, to evaluate neuroplasticity and astrocytic cell alterations, as well as assess the presence of excitatory and inhibitory projections between the insula and the anterior cingulate cortex (ACC). Male Sprague Dawley rats (280-340g; CEUA 3447131117) submitted to chronic constriction of the sciatic nerve in the right side (CCI) received a concentric electrode on the left posterior insula (1.0 mm caudal to bregma, 5.8 mm laterality, 7.1 mm deep) and underwent five consecutive daily stimulations (15 min, 60 Hz, 210 s, 1V). GABAA receptor antagonist, bicuculline methiodide, (0.1ug, i.t) administered 1h prior to the paw pressure test, induced reversion of the ESI-induced antinociception, without altering the general activity in the open field test. Increase of GAD65 in the insula after ESI was observed by immunofluorescence, without changes of GFAP, synaptophysin and/or tyrosine hydroxylase (TH) in insula, hippocampus, anterior and mid cingulate cortex, Periaqueductal Gray (PAG) and rostral ventromedial medulla (RVM). Western blotting analysis, revealed no changes in GAD65 after ESI. GABA, glutamate and glycine levels analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) did not change after EECI. In collaboration with the University of Calgary, GAD2Crex Ai9, PVCrexAi9, Vglut2CrexAi9 mice underwent Spared Nerve Injury (SNI) and injection of tract tracer choleric toxin-subunit B (CTB488). It has been demonstrated the presence of GABAergic, parvalbumin positive (PV+) and glutamatergic projections between the insula and the ACC, which were not activated by c-Fos in an immunofluorescence assay. GAD2-cre, PV-cre, and Vglut2-cre mice received adeno-associated viral titers for opsin expression (pAAV9-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -eYFP) in insula and a fiberoptic cannula was implanted in right insula (0.5 mm posterior to the bregma, 0.375 laterality, 4.0 mm deep) or right ACC (1.055 mm anterior to the bregma, 0.255 mm laterality, 1.522 mm deep). The animals underwent SNI surgery on the left sciatic nerve. 6 to 8 weeks after virus injection, animals were subjected to optostimulation (DPSS blue lasers 472 nm, 5 mW, 10 Hz or 40 Hz). Only the optogenetic activation of PV + neurons induced conditioned place preference, without changing the mechanical threshold in the Digital Plantar Anesthesiometer (DPA). The results obtained point out that GABAergic signaling partially participates in ESI-induced antinociception, as well as demonstrates the presence of GABAergic, PV + and glutamatergic projections between the insula and the ACC, and their influence on pain modulation in neuropathic pain models.