No presente estudo investigamos se a hipertensão neurogênica decorrente da sobrecarga de sal (SS) estimula a liberação de ATP no PVN e quais mecanismos seriam responsáveis por este fenômeno. Duas hipóteses foram levantadas: (1) um maior conteúdo de ATP no PVN durante a SS é resultado de uma falha das ectonucleotidases em metabolizar o ATP; e (2) a SS estimularia os astrócitos do PVN a liberar ATP. Para testar nossas hipóteses utilizamos ratos Wistar pesando entre 290-350 g (n = 12) para estudos in vivo de medida de pressão arterial por radiotelemetria e análise de parâmetros da modulação autonômica do sistema cardiovascular e ratos Sprague Dawley com peso entre 290-350 g (n = 41) para os estudos in vitro com utilização de biossensores para detecção de purinas e imunohistoquímica. Ambos grupos foram divididos em um grupo SS que recebeu solução de NaCl 2% em substituição à água da torneira por 4 ou 7 dias e outro grupo controle que recebeu água. A progressão da hipertensão em ratos acordados expostos à SS foi monitorada por radiotelemetria ao longo de sete dias. A expressão do RNAm das ectonucleotidases ecto-nucleotídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPD) 1, 2 e 3 e ecto-5'-nucleotidase (E-5-NT) no PVN foi analisada com a técnica RT- qPCR. Utilizando biossensores amperométricos medimos a liberação de ATP e adenosina, bem como a atividade das ectonucleotidases no PVN em fatias hipotalâmicas. A função dos astrócitos do PVN foi avaliada por meio da interferência gênica com o vetor AVV-sGFAP-dnSNARE-EGFP. Os níveis de pressão arterial média (PAM) dos ratos SS aumentaram progressivamente até ao 7º de exposição ao sal [PAM: 97 ± 4 mmHg (dia 0) vs 129 ± 4 mmHg (dia 7) p<0,0001]. A potência da banda LF aumentou progressivamente do dia 0 ao dia 7 em ratos SS [LF: 1,21 ± 0,22 mmHg² (dia 0) vs 5,01 ± 0,96 mmHg² (dia 6), p<0,0001]. Apenas o nível de mRNA da E-NTPD3 foi maior no grupo SS do que no controle no dia 7 [0,99 ± 0,5 ΔΔCt (controle) vs. 3,09 ± 0,5ΔΔCt (SS) p = 0,0247]. O grupo de ratos SS apresentou aumento na liberação de ATP (19,16 ± 6,9 μM, p<0,0001) quando comparado ao grupo controle (1,13 ± 0,8 μM), porém não na liberação de adenosina [1,19 ± 0,6 μM (SS) vs 2,15 ± 0,9 μM (controle)]. A atividade das ectonucleotidases foi avaliada in vitro quantificando a produção máxima de adenosina em resposta à aplicação exógena de ATP (50μM). Nenhuma diferença foi detectada comparando as respostas entre os dois grupos. A intensidade da imunofluorescência da proteína glial fibrilar glial (GFAP) foi maior no PVN de ratos SS do que nos controles [6,9 ± 1,3 a.u. (controle) vs 27,2 ± 6,2 a.u. (SS)]. A transfecção unilateral do PVN com vetor dnSNARE diminuiu a liberação de ATP nos ratos SS quando comparado com o lado não transfectado como controle [13,88 ± 0,07 μM (lado não transfectado) vs. 6,64 ± 1,64 μM (lado transfectado). Em conclusão, nossos resultados mostram que a SS dada pelo suprimento de solução hipertônica com NaCl 2% aumenta gradativamente a PA bem como a influência simpática sobre o sistema cardiovascular e estimula a liberação glial exocitótica de ATP no microambiente do PVN.

In the present study we investigated whether salt-load (SS) stimulates the release of ATP in the PVN environment, and which mechanism would be responsible for this phenomenon. Two hypotheses have been raised: (1) a higher content of ATP in PVN during SS is a result of a failure of ectonucleotidases to metabolize ATP; and (2) SS can stimulate PVN astrocytes to release ATP. Male Wistar rats 290-350 g (n = 12) were used for in vivo studies and Sprague Dawley rats 290-350 g (n = 41) for in vitro. Animals were divided in 2 group: 1) SS: group that received hypertonic saline solution (2% NaCl) in replacement of tap water for 4 or 7 days, and 2) control group. A radiotelemetry system was used to measure the progression of hypertension in SS rats over the seven days of salt loading. mRNA expression of ecto-nucleotide triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPD) 1, 2 and 3 and ecto-5'-nucleotidase (E-5'-NT) in PVN was analyzed by RT-qPCR. The release of ATP, adenosine and the activity of ectonucleotidases were measured via amperometric biosensors overlaid on the PVN region of hypothalamic slices. The function of PVN astrocytes was assessed by interference with the AVV-sGFAP-dnSNARE-EGFP vector. Mean arterial pressure (MAP) of SS rats increased progressively from day 2 to 7 [MAP: 97 ± 4 mmHg (day 0) vs 129 ± 4 mmHg (day 7), p<0.0001]. The power of the LF component increased progressively from day 0 to day 7 in SS rats [LF: 1.21 ± 0.22 mmHg2 (day 0) vs 5.01 ± 0.96 mmHg2 (day 6), p<0.0001]. E-NTPD3 mRNA expression was higher in the SS group than in control [0.99 ± 0.5 ΔΔCt (control) vs. 3.09 ± 0.5ΔΔCt (SS) p = 0.0247]. SS rats showed an increase in ATP release [1.13 ± 0.8 μM (control) vs. 19.16 ± 6.9 μM (SS), p<0,0001], but not in adenosine [2.15 ± 0.9 μM (control) vs. 1.19 ± 0.6 μM (SS)]. The activity of ectonucleotidases was tested in vitro by quantifying the maximum production of adenosine in response to exogenous application of ATP (50μM). No difference was detected when comparing the responses between the groups. PVN glial fibrillar glial protein (GFAP) immunofluorescence intensity was higher in SS rats than in control [6.9 ± 1.3 a.u. (control) vs 27.2 ± 6.2 a.u. (SS)]. PVN unilateral transfection with dn-SNARE vector decreased the release of ATP in SS rats when compared to the non-transfected side as a control [13.88 ± 0.07 μM (non-transfected side) vs. 6.64 ± 1.64 μM (transfected side). In conclusion, our results showed that SS gradually increases the BP as well as the sympathetic influence on the cardiovascular system and stimulates the glial release of ATP in the PVN by exocytosis.