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Mémoire de Maîtrise
DOI
https://doi.org/10.11606/D.42.2019.tde-10092020-195333
Document
Auteur
Nom complet
Amanda Schukarucha Gomes
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2019
Directeur
Jury
Abdulkader, Fernando Rodrigues de Moraes (Président)
Carneiro, Everardo Magalhães
Pasquale, Roberto de
Pereira, Gustavo José da Silva
Titre en portugais
A alta concentração de glicose afeta a sinalização e o transporte de glicina em células secretoras de insulina?.
Mots-clés en portugais
Células β
Células INS-1E
Concentração extracelular de glicose
Receptores de glicina
Transportadores de glicina
Resumé en portugais
As células β pancreáticas secretam insulina, um hormônio essencial para a homeostase glicêmica. Sua secreção é principalmente desencadeada por aumento na concentração extracelular de glicose, com deflagração de potenciais de ação, e é influenciada por vários neurotransmissores presentes nas ilhotas pancreáticas. Entre eles está a glicina, cujo papel nessas células só começou a ser elucidado recentemente. Os seus transportadores de membrana 1 (GlyT1) e 2 (GlyT2) medeiam a captação deste aminoácido do meio extracelular para o intracelular, o que afeta a sua disponibilidade nas vizinhanças da face extracelular da membrana plasmática. Portanto, os GlyTs podem modular de forma indireta a sinalização da glicina. Esse neurotransmissor age através de seus receptores ionotrópicos (GlyRs), os quais são canais iônicos ativados por ligante, seletivamente permeáveis ao íon cloreto. Os GlyRs são formados por diferentes combinações de suas 5 subunidades (&alfa;1-4 e β). Já foi demonstrado que esses receptores estão presentes e são funcionais nas células β humanas, participando de uma retroalimentação positiva na secreção de insulina. Porém, viu-se que em ilhotas de doadores diabéticos os receptores de glicina possuem menor atividade. Não se sabe os mecanismos por trás desse achado. O objetivo deste trabalho foi investigar se a exposição crônica das células beta a diferentes concentrações de glicose, um fator presente no diabetes, é responsável por alterar a sinalização pelos GlyRs, através de mudanças em sua expressão e/ou em sua atividade. Para isso nós cultivamos a linhagem de células β INS-1E por 24 horas em concentrações de glicose 3 mM, 11.1 mM e 30 mM. Os tratamentos utilizados não influenciaram na viabilidade das células, verificada por citometria de fluxo. Nós quantificamos a expressão gênica dos GlyTs e das subunidades dos GlyRs, através de qPCR. A expressão das subunidades &alfa;1, &alfa;3 e β dos GlyRs não foi influenciada pelas diferentes concentrações de glicose utilizadas. Já a expressão dos GlyTs foi modulada pelas diferentes concentrações de glicose, com aumento relativo da expressão de GlyT1 em glicose 3 mM em relação às demais concentrações. Contrariamente, a expressão de GlyT2 acompanhou o aumento da concentração de glicose no meio de cultivo. Entretanto, experimentos em que a condição de alta concentração de glicose foi comparada a um controle osmótico com adição equimolar de manitol sobre a concentração de glicose basal não demonstraram diferenças na expressão dos GlyTs entre essas condições, bem como à adição de anticorpo anti-insulina ao meio de cultivo. Nós registramos a corrente elétrica dessas células pela técnica de whole-cell patch-clamp, e encontramos indícios de correntes induzidas pela glicina. Portanto, demonstramos neste trabalho a expressão dos receptores e dos transportadores de glicina nas células INS-1E, e encontramos evidências eletrofisiológicas que indicam que os GlyRs são funcionais nessa linhagem, validando esse modelo celular para o estudo da regulação da secreção de insulina pela glicina. As alterações aqui relatadas na expressão dos transportadores de glicina com a variação da concentração de glicose parecem refletir uma resposta à alteração da osmolaridade, em lugar de uma resposta metabólica à glicose ou à sinalização de insulina.
Titre en anglais
Does high glucose concentration affect the glycine signaling and transport in insulin secreting cells?.
Mots-clés en anglais
β cells
Extracellular glucose concentration
Glycine receptors
Glycine transporters
INS-1E cells
Resumé en anglais
The pancreatic β cells secrete insulin, an essential hormone for glucose homeostasis. Its secretion is elicited by an increase in the extracellular glucose concentration, with the triggering of action potentials, and can be influenced by various neurotransmitters found in the pancreatic islets. Among them is glycine, whose role in these cells was only recently unraveled. Its membrane transporters 1 (GlyT1) and 2 (GlyT2) mediate the cellular uptake of this amino acid from the extracellular to the intracellular compartment, which affects its disponibility in the vicinities of the extracellular plasma membrane. Therefore, the GlyTs can indirectly affect the glycine signaling. This neurotransmitter acts through its ionotropic receptors (GlyRs), which are ligand-gated ion channels, selectively permeable to the ion chloride. These channels can be composed by different combinations of its 5 subunits (&alfa;1-4 and β). It has been demonstrated that these receptors are present and functional in human β cells, and they participate in a positive feedback loop during insulin secretion. However, in islets from diabetic donors, the GlyRs activity is diminished, and the mechanisms responsible for this difference are still unknown. Our study aimed to investigate if the exposure of the β cells to different glucose concentrations, a main feature of diabetes, is responsible for this difference in the physiological role of the GlyRs, through changes in its expression and/or its activity. For that we used the β cell line INS-1E, and cultivated these cells for 24 hours in 3 mM, 11.1 mM or 30 mM glucose. The treatments used did not affect the cell viability, measured by flow citometry. We quantified the genetic expression of the GlyRs subunits and of the GlyTs, through qPCR. The gene expression of the GlyRs subunits &alfa;1, &alfa;3 and β was not influenced by the different glucose concentrations used. The GlyTs expression was modulated by the different glucose concentrations, with a relative increase in the expression of the GlyT1 in 3 mM glucose in comparison with the other concentrations. Conversely, the expression of the GlyT2 followed the increase of glucose concentration in the media. However, in experiments were the high glucose condition was compared to an osmotic control with the equimolar addition of mannitol to the basal glucose concentration, and with the addition of anti-insulin antibody to the culture media, there was no difference in the expression of the GlyTs. We recorded the electric current of these cells though though the whole cell patch-clamp technique, and found signs of glycine-induced currents. Therefore, we demonstrate in this work the expression of the glycine receptors and transporters, and we found electrophysiological evidence which indicates that the GlyRs are functional in the INS-1E cells. This validates this cell model for the study of the insulin secretion regulation by glycine. The alterations here reported in the expression of the GlyTs in the different glucose concentrations seem to reflect a response to the osmolarity changes, instead of a metabolic response to the glucose or to the insulin signaling.
 
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Date de Libération
2022-09-10
Date de Publication
2022-01-07
 
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