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Thèse de Doctorat
DOI
https://doi.org/10.11606/T.42.2020.tde-03012022-095722
Document
Auteur
Nom complet
Eloísa Aparecida Vilas Bôas
Unité de l'USP
Domain de Connaissance
Date de Soutenance
Editeur
São Paulo, 2020
Directeur
Jury
Carpinelli, Angelo Rafael (Président)
Carvalho, Carla Roberta de Oliveira
Roma, Leticia Prates
Souza, Kleber Luiz de Araujo e
Titre en portugais
Papel da NADPH oxidase durante a insulite e a lipotoxicidade: estresse oxidativo, disfunção e morte de células beta pancreáticas.
Mots-clés en portugais
ácido palmítico
células beta pancreáticas
citocinas pró-inflamatórias
diabetes tipo 1
diabetes tipo 2
espécies reativas de oxigênio
estresse oxidativo
Insulite
Lipotoxicidade
NADPH oxidase
NOX2
Resumé en portugais
As duas principais formas de diabetes mellitus (DM) apresentam etiologias distintas, porém um desfecho clínico comum, a hiperglicemia. No DM1, uma inflamação específica e persistente nas ilhotas pancreáticas (insulite) leva à disfunção e perda massiva das células beta. No DM2, o alto consumo de nutrientes e o aumento da resistência à ação periférica da insulina levam ao aumento da demanda de insulina em um contexto de exposição prolongada das células beta a altas concentrações de glicose e ácidos graxos (glicolipotoxicidade), culminando com a disfunção e perda de células beta. Em ambos os casos de DM há, portanto, uma disfunção celular progressiva. As citocinas pró-inflamatórias produzidas durante a insulite no DM1 e a glicolipoxicidade durante o DM2 contribuem para o desencadeamento do estresse de retículo endoplasmático (RE) e do aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs) e estresse oxidativo. Dentre todas as fontes de EROs, as NADPH oxidases (NOX) são as únicas que aparentemente produzem EROs como função principal. As EROs derivadas da NOX são importantes sinalizadoras para a secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS), porém também podem levar à disfunção das células beta. Apesar de muitos esforços, ainda não somos capazes de distinguir entre a produção fisiológica e patológica de EROs. Algumas limitações têm sido a utilização de sensores redox pouco específicos, que não dizem com precisão o tipo de espécie produzida ou qual o compartimento de produção, além da utilização de inibidores sem especificidade à NOX ou às suas diferentes isoformas. Como essas espécies são rapidamente removidas pelo sistema antioxidante intracelular, elas devem ser relevantes, sobretudo, em locais próximos à sua produção. Levando isso em conta, utilizamos ilhotas de camundongos expostas a condições que mimetizam o DM1 (citocinas pró-inflamatórias) ou DM2 (ácido palmítico) e avaliamos: 1) a produção estática de superóxido; 2) a produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) em tempo real e em diferentes compartimentos; 3) as variações em tempo real de NAD(P)H e 4) o envolvimento de isoformas da NOX na produção de H2O2, tolerância à glicose, secreção de insulina, viabilidade celular, homeostase de cálcio e ativação do estresse de RE. Com esses experimentos mostramos, pela primeira vez, a variação temporal da produção de EROs em células beta pancreáticas nessas condições. Nossos resultados indicam um aumento de superóxido entre 2 e 8 horas após exposição às citocinas e, com um sensor redox específico (roGFP2-Orp1) expresso exclusivamente na matriz mitocondrial ou no citosol/núcleo, mostramos que o citosol/núcleo apresenta papel principal na produção de H2O2 induzida por citocinas ou ácido palmítico, com pico entre 4 e 5 horas. Mostramos também a participação da mitocôndria na produção de H2O2 em ilhotas expostas ao ácido palmítico, porém sem relevância frente às citocinas. O pico de produção de H2O2 citosólico/nuclear coincide com uma diminuição de NAD(P)H intracelular e foi completamente eliminado em ilhotas NOX2 knockout (KO). Animais NOX2 KO apresentaram melhor tolerância à glicose e suas ilhotas foram protegidas da disfunção secretória e da morte induzida por citocinas ou ácido palmítico. Curiosamente, a ausência de NOX2 piorou a homeostase de cálcio total em ilhotas expostas às citocinas, mas foi mantida em ilhotas expostas ao ácido palmítico. As citocinas e o ácido palmítico levaram à depleção do cálcio de RE, com consequente aumento no mecanismo de entrada de cálcio operada por estoque (SOCE). Em ilhotas expostas às citocinas, não observamos envolvimento claro da NOX2 no SOCE. Por outro lado, ilhotas NOX2 KO tiveram um menor SOCE após a exposição ao ácido palmítico, quando comparadas às ilhotas WT, indicando que o H2O2 citosólico possa estar envolvido na regulação do SOCE e/ou níveis de cálcio de RE nessas condições. Ilhotas NOX1 KO, mas não ilhotas NOX2 KO, foram protegidas do estresse de RE induzido por citocinas, porém não observamos envolvimento de NOX no estresse de RE induzido por ácido palmítico. Por fim, avaliamos os efeitos in vivo da ausência de NOX no pâncreas e nas células beta, após indução de DM1 via injeções de doses baixas e múltiplas de estreptozotocina em animais NOX1 KO ou NOX2 KO. Ilhotas NOX2 KO de animais diabéticos foram protegidas de alguns parâmetros deletérios encontrados normalmente no desenvolvimento de diabetes, como a diminuição na circularidade e a diminuição da marcação de insulina. Porém, a perda de NOX1 parece prejudicar a proliferação celular nas ilhotas. Fica evidente a complexidade do papel da NOX tanto na funcionalidade, quanto na sobrevivência das células beta. Propomos que a inibição da NOX2 pode funcionar como uma terapia potencial contra a disfunção precoce de células beta induzida por citocinas pró-inflamatórias e ácidos graxos, no contexto do DM1 e do DM2.
Titre en anglais
Role of NADPH oxidase during insulitis and lipotoxicity: oxidative stress, dysfunction and death of pancreatic beta cells.
Mots-clés en anglais
insulitis
lipotoxicity
NADPH oxidase
NOX2
oxidative stress
palmitic acid
pancreatic beta cells
pro-inflammatory cytokines
reactive oxygen species
type 1 diabetes
type 2 diabetes
Resumé en anglais
The two main types of diabetes mellitus (DM) have distinct etiologies, but a common clinical outcome, the hyperglycemia. In type 1 diabetes (T1D), a specific and persistent inflammation in the pancreatic islets (insulitis) leads to beta cells dysfunction and massive loss. In T2D, high consumption of nutrients and increased resistance to the peripheral action of insulin lead to increased demand for insulin in a context of prolonged exposure of beta cells to high concentrations of glucose and fatty acids (glucolipotoxicity), culminating in the dysfunction and loss of beta cells. In both types of DM, therefore, there is a progressive cellular dysfunction. The pro-inflammatory cytokines locally produced during insulitis in T1D and the glucolipotoxicity during T2D contribute to the triggering of the endoplasmic reticulum (ER) stress and the increase of reactive oxygen species (ROS) and the oxidative stress. Among all sources of ROS, the NADPH oxidases (NOX) are the only ones that apparently produce ROS as a main function. NOX-derived ROS are important signaling molecules for the glucose-stimulated insulin secretion (GSIS), however they may also lead to the beta cells dysfunction. Despite many efforts, we are still unable to distinguish between the physiological and pathological ROS production. Some of the limitations include the use of nonspecific redox sensors, which do not accurately distinguish the type of species being produced or the compartment of production, in addition to the use of inhibitors without specificity to NOX or its different isoforms. As these species are rapidly removed by the intracellular antioxidant system, they should be relevant, especially in places close to their production. Taking this into account, we used mice islets exposed to conditions that mimic T1D (pro-inflammatory cytokines) or T2D (palmitic acid) and evaluated: 1) static production of superoxide; 2) real-time production of hydrogen peroxide (H2O2) in different compartments; 3) real-time assessment of NAD(P)H levels and 4) the involvement of NOX isoforms in H2O2 production, glucose tolerance, insulin secretion, cell viability, calcium homeostasis and activation of ER stress. With these experiments, we show, for the first time, the temporal variation of ROS production in pancreatic beta cells under these conditions. Our results indicate an increase of superoxide between 2 and 8 hours after exposure to the cytokines and, with a specific redox sensor (roGFP2-Orp1) exclusively expressed in the mitochondrial matrix or in the cytosol/nucleus, we show that the cytosol/nucleus plays a major role in the H2O2 production induced by cytokines or palmitic acid, peaking between 4 and 5 hours. We also show the participation of mitochondria in H2O2 production in islets exposed to palmitic acid, although with no relevance to cytokines. The cytosolic/nuclear peak of H2O2 coincides with a decrease of intracellular NAD(P)H and was completely eliminated in NOX2 knockout (KO) islets. NOX2 KO animals presented better glucose tolerance and their islets were protected against the secretory dysfunction and death induced by cytokines or palmitic acid. Interestingly, the absence of NOX2 worsened the total calcium homeostasis in islets exposed to the cytokines, but was maintained in islets exposed to palmitic acid. Cytokines and palmitic acid led to the depletion of ER calcium, with a consequent increase in the Store Operated Calcium Entry (SOCE) mechanism. In islets exposed to the cytokines, we did not observe a clear involvement of NOX2 in SOCE. On the other hand, NOX2 KO islets had lower SOCE after exposure to palmitic acid, when compared to WT islets, indicating that cytosolic H2O2 might be involved in the regulation of SOCE and/or ER calcium levels in these conditions. NOX1 KO, but not NOX2 KO, islets were protected from the ER stress induced by cytokines; however we did not observe involvement of NOX in the ER stress induced by palmitic acid. Finally, we evaluated the in vivo effects of NOX absence in the pancreas and beta cells, after T1D induction via injections of multiple low doses of streptozotocin in NOX1 KO or NOX2 KO animals. Islets from diabetic NOX2 KO were protected from some deleterious parameters normally found in the development of diabetes, such as decreased circularity and decreased insulin labeling. However, absence of NOX1 appears to impair cell proliferation in islets. The complexity of the role of NOX in beta cell functionality and survival is evident. We propose that NOX2 inhibition might be a potential therapy against early beta cells dysfunction induced by pro-inflammatory cytokines or fatty acids, in the context of T1D and T2D.
 
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Date de Publication
2022-12-13
 
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